结合态淀粉合成酶（GBSS）检测试剂盒微量法活性说明书

测定意义：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

测定原理：

GBSS 催化ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP； 进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为 NADPH，其中 NADPH 生成量与前一步反应生成的 ADP 数量呈正比，通过 340nm 下测定 NADPH的增加量，可以计算 GBSS 活性。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×2 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 14mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 8mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂五：液体×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μ L 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μ L 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

结合态淀粉合成酶（GBSS）检测试剂盒粗酶液制备:

称取 0.1~0.2g 组织（建议称取约 0.1g 组织），加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g ， 4℃离心10min，弃上清，在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀，置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃保温 20 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却

混匀，30℃保温 30 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10000g 25℃离心 10min，取上清液（如果一次性测定样本较多，可以将试剂四、五和六按比例配成混合液）

混匀后立即 340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度 A2，计算 Δ A=A2-A1。注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

结合态淀粉合成酶（GBSS）检测试剂盒GBSS 活性计算:

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。GBSS（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数

=528×Δ A÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T× 稀释倍数=528×Δ A÷W

V 反总：反应体系总体积，2.85×10-4 L；ε ：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。GBSS（nmol/min /mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数

=1056×Δ A÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T× 稀释倍数=1056×Δ A÷W

结合态淀粉合成酶（GBSS）检测试剂盒V 反总：反应体系总体积，2.85×10-4 L；ε ：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL； T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。