乙醇脱氢酶（ADH）检测试剂盒-,微量法合肥莱尔生物科技有限公司手机版

详细介绍

乙醇脱氢酶（ADH）检测试剂盒微量法检测说明书活性

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD+没有；测定340nm 吸光度下降速率，来计算 ADH 活性。

自备实验用品及仪器：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。临用前把试剂三转移到试剂二中，4℃保存。试剂三：粉剂×1 支，－20℃保存。

试剂四：液体×1 支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；16000g， 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

乙醇脱氢酶（ADH）检测试剂盒ADH 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴中保温 30 min。

3. 空白管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μ L 蒸馏水、160μ L 试剂二和 20μ L 试剂四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1 和 A2。△A 空白管=A1-A2。

4. 测定管：在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μ L 上清液、160μ L 试剂二和 20μ L 试剂四，迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A3 和 A4。△A 测定管=A3-A4。

注意：空白管只需测定一次。

计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μ mol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μ mol/min/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T

=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1μ mol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μ mol/min/g 鲜重) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×106] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μ mol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μ mol/min/104cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×106] ÷(细胞数量

×V 样÷V 样总)÷T

=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1μ mol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (μ mol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×106] ÷V 样÷T

=1.61×(△A 测定管–△A 空白管)

ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，200μ L=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μ L=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

乙醇脱氢酶（ADH）检测试剂盒b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下