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海藻糖含量检测试剂盒说明书(可见分光光度法)
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:YX-C-B605
规格:50T/48S
产品内容:
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存;
标准品:粉剂×1 支,含 10mg 海藻糖。
产品说明:
海藻糖存在于大量有机体中,包括细菌、藻类、酵母、植物、昆虫和其他无脊椎动物。由于海藻糖具有*的不同于其他碳水化合物的生物学特性,能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。
测定方法:
采用蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷,如果样本中含有可溶性糖,则会影响测定。本试剂盒建议用于除海藻糖外不含其他可溶性糖样本的测定。
海藻糖含量检测试剂盒试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研钵、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤:
一、海藻糖提取:
1、 细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),室温静置 45min,振荡 3~5 次,冷却后,8000g,常温离心,取上清。
2、 组织的处理:称取约 0.1g 样本,常温研碎,加入 1mL 提取液,室温静置 45min,振荡 3~5 次, 冷却后,8000g,常温离心,取上清。
3、 血清(浆)的处理:吸取约 100μL 血清(浆),加入 0.9mL 提取液,室温静置 45min,振荡 3~5次,冷却后,8000g,常温离心,取上清。
4、 标准品的处理:标准品用 1mL 双蒸水溶解,溶液浓度为 10mg/mL,稀释到 0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0mg/mL。
二、测定操作表:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 620nm,蒸馏水调零。
2、 调节水浴锅至 95 度。
3、 工作液的配制:临用前在每瓶试剂一中加入 16mL 蒸馏水后,缓慢加入 64mL 浓硫酸,不断搅拌, 充分溶解,待用。用不完的试剂 4℃保存一周。
4、 标准曲线的建立:取 0.25mL 标准液和 1mL 工作液至 EP 管中,95 度水浴 10min(盖紧,防止水分散失),自然冷却至室温,取 1mL 至比色皿中,在 620nm 处测吸光值 A。根据标准样本的浓度(y)和吸光度(x)建立标准曲线。
5、 样本测定:取 0.25mL 样本和 1mL 工作液至 EP 管中,95 度水浴 10min(盖紧,防止水分散失), 自然冷却至室温,取 1mL 至比色皿中,在 620nm 处测吸光值 A。
注意:若吸光值大于 1,请将样本用提取液稀释后再测定,计算公式中乘以相应的稀释倍数。
海藻糖含量检测试剂盒三、海藻糖含量计算:
1、 根据标准曲线计算样本中海藻糖的含量 y(mg/mL)。
2、 按样本鲜重计算:
海藻糖含量(mg/g 鲜重)= V1×y÷(W×V1÷V2)=y ÷W。
3、 按样本蛋白浓度计算:
海藻糖含量(mg/mg prot)=V1×y÷(V1×Cpr)=y÷Cpr。
4、 按细菌或细胞数量计算:
海藻糖含量(μg/104 cell)=(1000 × V1 × y)÷(500 × V1÷V2)=2× y
5、 按血清(浆)体积含量计算:
海藻糖含量(mg/mL)=(V1×y)÷(V3×V1÷V2)=10×y
1000:1mg/mL=1000μg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.25 mL;V2:提取液总体积,1mL; V3:加入血清(浆)体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。海藻糖含量检测试剂盒