血清在细胞培养中的作用及正确使用血清的方法

　　血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成(称为必需氨基酸)，必须由培养液提供。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等);血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清，动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。

　　常用血清种类：

　　目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用兔血清、马血清等。

　　选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。

　　牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用兔血清、马血清等其他血清。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。

　　牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然，胎牛血清是品质高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

　　常见血清及规格：

　　胎牛血清：(八月龄胎牛心脏穿刺取血)

　　适用于细胞株保藏及娇贵细胞培养。

　　超级新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，采血后静置自然析出的血清)

　　适用于淋巴细胞、骨髓瘤细胞、二倍体细胞等基础生物医学研究。

　　标准新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，经离心分离的血清)

　　BVDV 抗原抗体均阴性，适用于原代、传代细胞培养和人用疫苗(vaccine)生产和研制。特别适用于猪瘟疫苗(vaccine)的研制、生产。

　　普通新生牛血清：(出生12～24小时新生牛静脉采血，融血或微融血的血清)

　　适用于普通原代、传代细胞培养和兽用疫苗(vaccine)及诊断试剂生产

　　小牛血清：(出生三月龄小牛动脉采血分离血清)

　　适用于生物医学研究等。

　　大牛血清： 适用于标准蛋白液、及牛血清白蛋白制备等。

　　马血清： 适用于兽用疫苗(vaccine)生产和诊断试剂生产。

　　山羊血清：适用于生物医学研究基础等。

　　血清质量的差异性大如何选择

　　市场上各种血清产品鱼龙混珠，一不小心，你可能就使用了品质不好的血清。

　　血清按照采血时间可分为胎牛血清、新生牛血清和小牛血清，三者的优劣顺序为：胎牛血清>新生牛血清>小牛血清。

　　一般细胞建议使用胎牛血清培养，部分细胞可使用新生牛血清培养，小牛血清则不建议用于细胞培养。

　　血清在生产中受采血来源，条件和生产工艺等的影响，质量差异较大，即使相同厂家不同批次的血清都会有差异;另外不同种类的细胞对血清的适应也有不同，这可能与血清中所含的生长因子有关，所以血清在使用之前应提前验证一下对所培养的细胞生长的促进作用。

　　培养细胞用的培养基为人工合成，但动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，加入动物血清是为了给体外培养的细胞提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育主要作用有

　　a、提供基本营养物质或合成培养基所缺乏的营养物质：如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等;

　　b、提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子;

　　c、提供贴壁细胞所需的贴壁因子和扩展因子;

　　d、对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使细胞免受蛋白酶的损伤;

　　e、血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用;

　　f、血清中的结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。

　　细胞培养中如何正确使用和保存血清

　　保存：胎牛血清一般在-20℃以下冷冻保存，使用之前应先放到2~8℃冰箱过夜溶解，不建议直接放到室温或37℃水浴溶解(升温过快会导致血清中蛋白质大量沉淀，影响血清质量);若一次使用量不多，可溶解后分装至小包装冻存，避免反复冻融。血清解冻后在2~8℃保存时间一般不超过一个月。

　　灭活：一般血清使用时不需要灭活。灭活的作用是消除血清中的各种补体成分，但事实证明血清灭活之后会产生大量的沉淀，会对血清的营养物质造成较大破坏，对细胞的生长不利。

　　沉淀：血清中的沉淀一般为析出的纤维蛋白，另外新生牛血清中各种蛋白含量明显偏高，溶解时较易产生大量沉淀。血清中出现沉淀一般不会影响血清质量，并且升温至37℃时会溶解(不建议加热血清);若沉淀量较多，可在400×g离心3min，取上清使用。血清和添加了血清的培养基在使用时不需要过滤。

　　血清使用中可能遇到问题

　　a、如何更换使用血清

　　需要更换使用不同品牌或批次的血清之前，需提前对要使用的血清进行验证，可使用自己经常培养的细胞进行，保证该血清对细胞生长的促进作用。在更换使用时可以将要更换的血清和原本使用的血清1:1混合使用1~2代，待细胞适应后进行更换。

　　b、血清颜色的问题

　　血清颜色主要是黄色或红色，一般淡黄色或微红色为正常。这个主要受血红蛋白含量的影响，若颜色太深(接近培养基的颜色)，则有可能是采血过程中出现溶血导致的。

　　c、血清沉淀的问题

　　血清中的沉淀主要是纤维蛋白凝集产生的，一般来说每次冻融都会产生一部分的沉淀，但不影响血清质量和使用。另外，血清在加入到培养基中后也是有可能会产生沉淀的，特别是灭活后的血清，会持续产生黑色颗粒，这可能会被错误判断为污染。一般血清产生的沉淀在显微镜下观察为微小的不规则絮状或者颗粒物质，排查是否为污染办法是用琼脂板检测。

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