γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定(比色法)测试盒说明

　　注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

　　测定意义：

　　γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷a酸盐，在细胞外谷胱g肽新陈代谢中起了重要的作用。

　　测定原理：

　　γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘a酸，生成对硝基苯胺，在405nm有特征光吸收;通过测定405nm光吸收增加速率，来计算γ-GT酶活性。

　　自备仪器和用品：

　　低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水

　　试剂组成和配制：

　　试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

　　试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。

　　试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。

　　试剂四：液体14.8mL×1瓶，4℃保存。

　　工作液(在试剂二瓶中配制)：临用前配制，把试剂三倒入试剂二瓶中，充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解);然后把试剂四倒入试剂二瓶中，混匀后室温保存。

　　粗酶液提取：

　　组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

　　细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：试剂一体积(mL)为500~1000：1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min);然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。

　　3. 血清等液体：直接测定。

　　γ-GT测定操作:

　　1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到405 nm，蒸馏水调零。

　　2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min(保证无沉淀)。

　　3. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混匀后于405nm测定10s和70s时吸光度，记为A1和A2。

　　γ-GT活性计算：

　　标准曲线：y=0.006x+0.0016，x为对硝基苯胺浓度，y为吸光值，R2=0.999。

　　a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

　　(1). 按蛋白浓度计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(Cpr×V样)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

　　(2). 按样本质量计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/g 鲜重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

　　(3)按细胞数量计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷细胞数量

　　(4)按液体体积计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V反总÷V样÷T= 1.67 × [ (A2-A1)-0.0016]

　　V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10-4L;Cpr：蛋白浓度(mg/mL);W ：样品质量;V样：反应体系中加入上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL;V样总：提取液体积，1 mL;T：反应时间(min)，1min。

　　b.使用96孔板测定的计算公式如下

　　标准曲线：y=0.003x+0.0016，x为对硝基苯胺浓度，y为吸光值，R2=0.999。

　　(1). 按蛋白浓度计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(Cpr×V样)÷T=3.34× [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

　　(2). 按样本质量计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/g 鲜重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

　　(3)按细胞数量计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=3.34 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷细胞数量

　　(4)按液体体积计算

　　活性单位定义：25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为1个酶活单位。

　　γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.003×V反总÷V样÷T= 3.34 × [ (A2-A1)-0.0016]

　　V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10-4L;Cpr：蛋白浓度(mg/mL);W ：样品质量，g;V样：反应体系中加入上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL;V样总：提取液体积，1 mL;T：反应时间(min)，1min。

　　注意事项：

　　培养细胞中γ-GT活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。

　　配置好的工作液2周内使用完毕。

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