线粒体呼吸链复合体Ⅴ试剂盒正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸

馏水。

线粒体呼吸链复合体Ⅴ试剂盒试剂的组成和配制

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL 蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂九：液体 10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

线粒体呼吸链复合体Ⅴ试剂盒测定步骤

1、酶促反应

混匀，4000g，25℃离心 10min，取上清液

2、定磷

混匀，室温静置10min左右，在660nm处读 A测定管和A对照管，计算ΔA=A 测定管-A对照管。

复合体Ⅴ活性计算

标准条件下测定的回归方程为 y = 1.2487x + 0.0361；x为标准品浓度（mmol/L），y为A值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=64×(ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min/g 鲜重）=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V反总×106]÷(W×V样÷V样总) ÷T=51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min/104cell）=[(ΔA-0.0361)÷1.2487×V反总×106]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.103×(ΔA-0.0361)

线粒体呼吸链复合体Ⅴ试剂盒V 反总：反应体系总体积，6×10-4 L；V 样：加入样本体积，0.25 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。