细胞乙醛脱氢酶2活性比色法定量检测试剂盒实验步骤
- 发布时间：2022/4/14 14:49:10
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一、 样品准备
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意：可以使用胰l酶消化)
5. 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意：悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 强力涡旋震荡15秒
12. 置于冰槽里孵育30分钟
13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g(或13000RPM，例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意：建议使用GENMED Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-GMS30030.1)
16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃)：波长340nm，间隔60秒，读数5次(共5分钟)，并置零
2. 从-20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；GENMED底物液（Reagent E）避免光照；GENMED缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
3. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
4. 在25℃温度下孵育3分钟
5. 加入xx微升GENMED阴性液（Reagent F）
6. 上下倾倒数次，混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照(5分钟读数-0分钟读数)
四、 样品总活性测定
1。 移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
3. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
4. 在25℃温度下孵育3分钟
5. 加入20微升待测样品(或50微克蛋白)(注意：样品须清澈)
6. 上下倾倒数次，混匀(限定在3秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数(5分钟读数-0分钟读数)
五、 样品非特异活性测定
1. 移取xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2. 加入xx微升GENMED专性液（ReagentG）
3. 加入20微升待测样品(或50微克蛋白)(注意：样品须清澈)
4. 上下倾倒数次，混匀
5. 在25℃温度下孵育10分钟
6. 加入xx微升GENMED缓冲液（Reagent C）
7. 加入xx微升GENMED反应液（Reagent D）
8. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
9. 上下倾倒数次，混匀(限定在3秒之内)
10. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数(5分钟读数-0分钟读数)