还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒

 还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒微量法说明书，注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此，测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

测定原理：

DTNB与GSH反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度与GSH含量成正比。

自备实验用品及仪器：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 瓶，4℃避光保存。

还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测

3. 血清等液体：直接测定。

GSH测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴中保温30min。
3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μ L蒸馏水，140μ L试剂二，40μ L试剂三，混匀静置2min 后测定412nm吸光度A1。
4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μ L上清液，140μ L试剂二，40μ L试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度A2。
注意：空白管只需要测定一次。
GSH 含量计算公式：
GSH 标准曲线公式：y=1.5x（x为GSH浓度，μ mol /mL；y为吸光值） 

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
GSH（μ mol/mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V 反总÷V 样÷Cpr =6.67×(A2－A1) ÷Cpr
（2） 按样本质量计算
GSH（μ mol/g）=(A2－A1) ÷1.5×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)=6.67×(A2－A1) ÷W
（3） 按细胞数量计算
GSH（μ mol/104cell）=(A2－A1) ÷1.5×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)
=6.67×(A2－A1) ÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
GSH（μ mol/mL）=(A2－A1) ÷1.5×V 反总÷V 样 =6.67×(A2－A1)
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μ L=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量
还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒b.使用96孔板测定的计算公式如下
GSH 标准曲线公式：y=0.75x（x 为GSH浓度，μ mol/mL；y为吸光值）
（1） 按蛋白浓度计算
GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V 反总÷V 样÷Cpr =13.34×(A2－A1) ÷Cpr
（2） 按样本质量计算
GSH（μ mol/g）=(A2－A1) ÷0.75×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)=13.34×(A2－A1) ÷W
（3） 按细胞数量计算
GSH（μ mol /104cell）=(A2－A1) ÷0.75×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)
=13.34×(A2－A1) ÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷0.75×V 反总÷V 样 =6.67×(A2－A1)
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μ L=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量
还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒注意事项：
1.试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

2.检出限为1mmol/L。