己糖激酶（HK）检测试剂盒

己糖激酶(HK)检测试剂盒微量法说明书，正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；

己糖激酶(HK)检测试剂盒样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 在试剂二中加入 18mL 试剂一充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2） 在试剂三中加入 1mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μ L 样本、10μ L 试剂三和 180μ L 试剂二，混匀， 立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 Δ A=A2-A1。

注意：不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 Δ A>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至 2min,使 Δ A<0.5，以提高检测灵敏度。

HK 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）HK 活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。HK（nmol/min/mL）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷V 样÷T=643×Δ A

己糖激酶(HK)检测试剂盒2、组织、细菌或细胞中 HK 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。HK（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×Δ A÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min/g 鲜重）＝[Δ A×V 反总÷（ε  ×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×Δ A÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK （ nmol/min/104 cell ）＝ [Δ A×V 反总÷ （ ε ×d ） ×109]÷(500×V 样÷V 样总)

÷T=1.286×Δ A

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε ：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下1、血清（浆）HK 活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。HK（nmol/min/mL）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷V 样÷T=1286×Δ A

2、组织、细菌或细胞中 HK 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。HK（nmol/min/mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×Δ A÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

己糖激酶(HK)检测试剂盒单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（nmol/min/g 鲜重）＝[Δ A×V反总÷（ε  ×d）×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=1286×Δ A÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。HK（nmol/min/104 cell）＝[Δ A×V反总÷（ε  ×d）×109]÷(500×V 样÷V样总)÷T=2.572×Δ A V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε ：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数， 500 万