谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒

 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒微量法说明书
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义： 

GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理：

GSH-Px催化H2O2氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，室温保存。

试剂二：粉剂×瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 支，-20℃保存。

混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一 20mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。（当天用完）

试剂四：液体×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒GSH-Px 测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2. 混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min。
3. 空白管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20μ L蒸馏水、160μ L预热的混合试剂，20μ L试剂四，迅速混匀后于340nm 处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A空1和A空2。△A空白管= A 空1﹣A空2。
4. 测定管：依次在微量石英比色皿或96孔板中加入20μ L上清液、160μ L预热的混合试剂，
20μ L试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10s和第190s的吸光值，分别记为A测1和A测2。△A 测
定管=A测1﹣A测2。
GSH-Px 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）÷
T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)
÷T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
（3） 按细胞数量计算
活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/104cell)= [(△A测定管-△A空白管)÷ε ÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样
÷V样总)÷T=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px (nmol/min/mL)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷V 样÷T
=536×(△A 测定管-△A 空白管)
ε ：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积， 200μ L=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μ mol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W ：样品质量；V 样： 加入反应体系中上清液体积，20μ L =2×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3 min。

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算
GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每mg蛋白每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）
÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2). 按样本质量计算
GSH-Px活力单位定义：一定温度中，每g样本每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/g)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)
÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
（3） 按细胞数量计算
活性单位定义：一定温度中，每104个细胞每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。
GSH-Px (nmol/min/104cell)= [(△A测定管-△A空白管)÷ε ÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样
÷V样总)÷T=1072×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量
（4） 按液体体积计算
活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH氧化为1个酶活单位。GSH-Px (nmol/min/mL)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反总×109]÷V 样÷T
=1072×(△A 测定管-△A 空白管)
ε ：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103 L/mol