免疫印迹操作步骤
 
    1．主要内容
    检测限为2—20fmol，或约0．1～lng的50kDa蛋白质
    有多个操作步骤，需2天(或1天)时间完成。
    检测抗原的存在，定量及其大小。
    半定量至全定量。
    抗原的检测依赖于耐变性的表位。
    一般，低亲和力抗体亦可使用。
 
    2．操作步骤
    (1)将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。zui终的样品缓冲液条件是2％SDS、100mmol／LDTT(从lmol／L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于—20℃冷冻保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。01％溴酚蓝和10％甘油。全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用2％的样品缓冲液1：1进行稀释。加热至70℃ 10min。zui终蛋白质浓度应不超过150ug／每孔(微型胶不超过15pg／每孔)。
    (2)将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。在凝胶上作记号以确定方向。
    (3)剪1张硝酸纤维素膜和4张吸附滤纸(Whatman 3MM或替代物)，其大小与凝胶相当。
    (4)将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。将膜转入转印缓冲液中浸泡5min。将吸水纸浸泡于转印缓冲液中。转印缓冲液1(20 000～400 000kDa蛋白质)：48mmol／LTris，390mmol／L*、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。转印缓冲液2(<80 000kDa蛋白质)：25mmol／LTris、190mol／L*、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
    (5)将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其*浸泡。小心地将支持垫中的气泡排出。
    (6)组装转印夹层组合：依次为支持垫、2张吸水纸、凝胶、膜、2张吸水纸和支持垫。将组装好的夹层组合放入转印槽中，并使膜靠近正极(阳极，红色电极)。
    (7)于4C条件下转印过夜。分子质量>100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h，然后在84V转印14～16h。分子质量<100 000kDa的蛋白质，63V转印4～16h。
    (8)转印完成后，断开电源。卸下夹层组合装置，并在硝酸纤维素膜上作记号以保持原来的方向。
    (9)用PBS将膜清洗数次。
    (10)在室温下将膜放入5％脱脂奶粉／PBS中搅动孵育2h。然后从封闭液中取出印迹膜并用PBS漂洗2次，每次5min。
    (11)加入一抗溶液。15cmXl5cm印迹膜用10ml。所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。
    (12)在室温下将膜和抗体搅动孵育1h。用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5rain。
    (13)加入辣根过氧化物酶标记的二抗试剂。所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。对组织培养上清可以不稀释或1：10稀释。这样获得的抗体浓度为1Ps／ml和50ug／ml。如果是多克隆抗血清或腹水，将10ul稀释至10ml即可。如果抗体的浓度尚未知，需作若干稀释度以确定正确的浓度范围。
    (14)在室温下搅动孵育1h。用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5min。
    (15)在临用前，新鲜配制化学发光试剂。由于该试剂的半衰期非常短，故应按需配制。将膜放入此液内孵育lmin。
    (16)用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分过多的化学发光试剂。将印迹膜放入塑料袋中以确保干的表面与胶片接触。
    (17)将印迹膜在暗室中使胶片曝光lmin。冲洗胶片以确定待测抗原的正确曝光时间。曝光时间可短至几秒钟，也可长达数小时。