ELISA试剂盒操作篇丨常见问题及解决方案

  一、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作?

  温度是ELISA结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。

  二、如何获得良好线性的标准曲线?

  按照推荐方式保存标准品;溶解标准品之前需短暂离心，收集粉末;确保标准品溶解和混匀(大约10min)，然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且移液;显色的恰当终止;选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。

  三、ELISA实验为什么必须设置复孔?

  为获得准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测。因为复孔检测可以：

  计算平均值，确保实验结果准确;

  解决实验中误操作造成的跳孔现象;

  计算CV值，对实验的操作和试剂盒的度进行评估。

  四、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡?如何振荡?

  振荡孵育使反应充分，振荡洗涤使背景干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。

  孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触，使得反应过程加，OD值通常会比未振荡孵育的结果要高;洗涤过程振荡，可以使洗板干净，在很大程度上 能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。

  五、何时终止ELISA反应?

  ELISA实验终需要酶催化底物显色反应来完成，在佳时间终止反应是ELISA实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中，S5出现淡蓝色，S1 – S3有明显的阶梯型蓝色，便需要终止反应;或者根据高浓度标准品孔在620nm的OD值来决定，OD620=0.9-0.95之间时即可终止。

  六、为什么酶标仪读数时必须选用双波长?

  首先，酶标仪使用前务必预热10-15min，使测读结果稳定。其次，ELISA实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰(标本的浓度，干扰色等)。一般采用大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收;因此，双波长测定，可大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。

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