实验分享：骨组织切片实验前制备及相关染色

　　骨组织切片重要的前处理——脱钙

　　在病理科的日常工作中就出会收到带有骨头的病理组织标本，这种标本由于含有大量的磷酸钙和碳酸钙，一般非常的硬，如果不能做好前期处理，对我们的HE制片会造成不小的影响，如切片破损、刀痕严重等问题，那么怎样处理带有骨头的病理组织标本呢?这个时候就需要进行我们病理学中很常见的步骤了，就是组织脱钙，对于骨组织来说，脱钙是关键的步骤，能不能制出好的切片以及后期染色如何。

　　脱钙前的固定

　　通常情况下，组织中如果含有骨、软骨等在HE制片钱都是要经过脱钙才处理的。首先，骨组织固定时间要适当，至少要达到24h，但不得不超过48h。固定时间过短或过长都不行，固定时间太久会严重影响抗原，后续做免疫组化试验很可能出现假阴性。固定时间 太短切片会泛红，看起来很奇怪。由于很多实验室并非恒温实验室，但是固定时间又很长，因此建议放入4℃冰箱中固定，保持低温而稳定的环境，效果会比较好。

　　脱钙试剂的选择

　　1)常用的脱钙液有无机酸、有机酸、混合酸以及电解脱钙液等。10%-50%的甲酸水溶液是常用的有机酸。脱钙时间由甲酸的浓度而定，10%甲酸脱钙需要3天，而50%甲酸脱钙需2天。甲酸浓度越高，脱钙速度越快，但同时也会伤害骨组织，导致组织结构不完整，研究鼻腔这种精细结构时50%甲酸是不可取的。脱钙过程需勤换脱钙液，保持浓度，推荐在4℃冰箱中温和地脱钙。注意，千万不要过度脱钙，否则组织会被酸分解，到时整个组织就烂了。

　　2)另外一种有机酸是EDTA，即乙二胺四乙酸这是一种接近中性液体，可以螯合骨组织中的钙离子。理论上讲它是的科研用脱钙液，可以地保存骨组织的抗原性、酶类等，但它的脱钙至少需要2周，长的能到3个月。

　　3)无机酸一般为硝酸。脱钙强度太大，稍不注意组织就脱烂了，不易控制，一般不推荐使用。室温下，浓度在8%以上的硝酸脱钙，超过2天，组织会有明显缺损。

　　4)混合酸即有机酸和无机酸混合使用，但是脱钙效果不佳，用的较少。

　　脱钙后的漂洗

　　需要注意的是，不管是用无机酸还是有机酸又或者是混合酸，脱钙后都需要使用流水充分漂洗。这一步也非常重要。 如果是鼻腔这种精细的组织，则漂洗6h即可，以免组织吸水后膨胀导致原始位置偏移。 这是好的方法。可以洗去骨组织中残留的酸，从而保证骨组织PH为中性，这是保证后期染色正常的重要步骤。如果没有漂洗干净，后期染色会偏红，蓝色的细胞核也会模糊不清。

　　脱钙效果的判断

　　脱钙时间的掌握是制片成功的关键，脱钙时间太短，会造成切片时刀痕严重、切片破碎，脱钙时间过长，又会造成HE染色不佳、免疫组化染色也容易出现假阴性。那么我们该如何判断脱钙效果呢?经济、省事的方法就是使用针灸用的针，如果能轻松戳进骨组织，则代表脱钙。如果针身弯曲了还是扎不进去，那就更换新鲜的脱钙液，继续脱钙。

　　骨组织常做的染色

　　1.HE染色

　　HE染色是组织学中基础、使用广泛的染色手段，相信大家对此都不陌生。HE染色可以区分一般的骨组织结构和细胞，但单一的HE染色并不能区分新生骨组织的数量、胶原以及其他细胞状态，大多数都需要配合其他染色技术共同观察骨愈合状态。特别的，现在都需要对新生组织进行量化研究，HE染色显然是不能满足要求的。

　　2.Masson染色

　　Masson染色的颜色对比鲜明，可见明显的胶原纤维网(苯胺蓝染色则为蓝色，甲基绿则为绿色)，能较好地反映纤维组织的形态。其中，蓝色表示新形成的骨，红色表示成熟的骨组织。

　　3.番红O-固绿染色

　　番红O-固绿染色可直观反映关节软骨、软骨下的骨组织结构，嗜碱性的软骨与碱性染料番红 O 结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成蓝色，在关节软骨及软骨下骨的形态学研究中受到了欢迎。

　　4.Trap染色

　　Trap染色是用于检测骨组织、骨细胞中特征物质的染色，使破骨细胞呈红色，背景呈绿色或蓝色。抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)为破骨细胞的标志酶，特异地分布于破骨细胞中，为破骨细胞所，通常作为鉴别破骨细胞的重要标志物。

　　5.甲苯胺蓝染色

　　软骨基质对甲苯胺蓝的异染性，是因为软骨基质的主要成分是软骨黏蛋白、多糖物质，而酸性硫酸根与嗜碱性染料有亲和力。此法用于显示新生骨组织钙盐沉积，成骨细胞数目统计，观察软骨退变，软骨细胞坏死钙化，软骨基质裂隙，胶原纤维增生等病理改变。染色结果：软骨和成骨细胞呈蓝紫色，背景呈淡蓝色。

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