过氧化物酶(POD)活性的测定的实验步骤

　　【实验原理】

　　植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H2 02 ，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中 的葡萄糖氧化酶等。H2 02 的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除 H2 02 的重要保护酶，能将H2 02 分解为02 和H2 0, 从而使机体免受H2 02 的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。

　　(CAT)催化如下反应：

　　2 H2 02 →2 H2 0 + 02

　　本实验通过测定H2 02 的减少量来测定CAT的活性。

　　在H2 02 存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基b酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

　　【试剂药品

　　1.50m mol/l pH7.0的磷酸缓冲液

　　2.0.3% H2 02: 吸0.5ml 30% H2 02 加入pH7.0的磷酸缓冲液至 50ml

　　3.0.2% 愈创木酚 :秤0.2g愈创木酚加入pH7.0的磷酸缓冲液至 100ml

　　【实验步骤】

　　酶液的制备

　　1.称取叶片 0.25g ，加入5倍量的(M/V)pH7.0 的PBS 冰浴研磨 15000r/min

　　离心15min取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

　　2. CAT 活性的测定

　　在3ml的反应体系中，包括0.3% H2 02 1ml, H2 0 1.95ml, 最后加入0.05ml酶液

　　启动反应，测定波长240nm处的OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

　　3. POD 活性的测定

　　在3ml的反应体系中，包括0.3% H2 02 1ml, .0.2% 愈创木酚0.95ml,pH7.0的PBS 1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。

　　4. 用考马斯亮蓝 G-250法测定蛋白含量.

　　【实验结果及计算】

　　CAT和POD的酶活性以U/mg蛋白或U/gFW表示。

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