多重荧光免疫组化--TSA技术

　　基于酪胺信号放大(TSA)技术，多重荧光免疫组化(mIHC)利用抗原抗体反应对样本中多种蛋白标志物进行染色标记，米徕迪生物,实现在同一组织切片上多个靶标蛋白共同染色(最多可实现数十种蛋白的共染色)，从而通过荧光图像分析挖掘组织微环境中的复杂信息，如定量分析、共表达确定细胞分型、空间关系分析等等。

　　一、技术原理

　　酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。荧光标记的酪胺分子在H2O2环境下被二抗标记的HRP催化激活，产生大量的酶促反应，使荧光素在抗原-抗体结合部位与组织周围的蛋白残基结合，形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。

　　TSA技术原理是荧光染料与抗原直接结合，通过热处理或微波处理可洗脱一抗和二抗并同时保留与组织抗原共价结合的荧光素。米徕迪生物，因此可以通过使用不同的偶联染料多次循环实验对多种蛋白抗原进行荧光标记，实现一张组织切片上多个蛋白的共染色。

　　二、优势

　　①TSA技术可使荧光放大信号大幅增强，大约是普通荧光的3~10倍。

　　②一抗抗体的种属来源不限。

　　普通荧光免疫组化共染的不同靶标要求一抗抗体是不同的种属来源，而TSA技术每一轮染色后可以把上一轮的一抗和二抗洗掉，对后一轮染色无影响，因此同一种属来源的一抗并不影响实验结果。

　　③实验过程中无需严格避光，因荧光素稳定不容易淬灭，米徕迪生物，实验操作过程中即使没有避光也不影响实验结果，且染色后的玻片可以保存数月不淬灭，仍可以重新扫描。

　　三、实验步骤

　　1.脱蜡和水化

　　将切片组织依次放入烘箱内烤片1h→二jia 苯Ⅰ15min→二jia苯Ⅱ15min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ

　　2.抗原修复

　　根据一抗选择合适的修复液(酸性的柠檬酸钠缓冲液或碱性的Tris-EDTA缓冲液)，米徕迪生物，将切片组织浸没于修复液中加热至沸腾，中低火维持20 min，自然冷却至室温。

　　3.阻断过氧化物酶

　　用PBS洗涤三次，每次4 min。切片组织放入3%过氧化氢水溶液中，孵育15 min。用PBS洗涤三次，每次4 min。

　　4.封闭

　　在组织周围画阻水圈(防止抗体流走)，在圈内加入血清封闭 10min。

　　5.一抗孵育

　　轻轻甩去封闭液，在圈内滴加一抗工作液覆盖组织，米徕迪生物，于湿盒内4℃孵育过夜或者 37℃ 1~2h。

　　6.二抗孵育

　　用PBS洗涤三次，每次4 min。圈内加入配置好的HRP标记二抗(与一抗相应种属)，避光室温孵育30min。

　　7. TSA荧光染料反应

　　用PBS洗涤三次，每次4 min。古朵生物，圈内滴加TSA工作液孵育10min。PBS洗涤三次，每次4 min。

　　8、重复 2-7 步骤(选择对应的TSA荧光染料)

　　9、DAPI 细胞核染色

　　PBS洗涤三次，每次4 min。米徕迪生物，圈内滴加DAPI抗淬灭染液孵育10min。

　　10、 封片

　　PBS洗涤三次，每次4 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

　　11、使用荧光扫描仪对玻片组织进行全景扫描

　　四、注意事项

　　①染料充分溶解混匀，有的试剂盒是有机溶性，如有沉淀，一定要先过滤。

　　②实验过程中避免切片干燥，并注意避光。米徕迪生物，

　　③选择特异性高的一抗抗体。

　　④表达高的一抗搭配弱光，表达低的搭配强光。米徕迪生物，

　　⑤实验前做好方案设计，确定好染色顺序、修复条件，以及每个抗体搭配的荧光染料。

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