HNEpC细胞培养(人鼻粘膜上皮细胞)
时间:2024-03-31 阅读:199
细胞:HNEpC细胞
中文名称:人鼻粘膜上皮细胞
生长特性:贴壁
培养基:1640 培养基 血清:10%FBS(GIBCO胎牛血清)
冻存条件:50%基础培养基、40% FBS、10% DMSO
收到细胞后请尽快更换配套培养基,或自己配置的新鲜培养基(含15%血清),如因特殊情况需要继续使用原瓶培养基,请在原瓶培养基中额外添加10%的血清(原瓶培养基的继续使用时间最长不宜超过72小时)。
HNEpC细胞传代:
1):细胞密度约80%时,吸出原培养瓶中的培养基,PBS缓冲液润洗细胞两次,加2~3 ml 0.25% yi酶进行消化细胞(注意根据实际情况,把握消化时间)。
2):镜下观察消化情况,在细胞边缘缩小,贴壁松动时;
(可用吸管吸起些许yi酶轻轻吹打细胞层某处,即可肉眼可见细胞层脱落,或吹打后镜下观察吹打处,即消化完成,否则继续消化)
直接吸掉yi酶,加3~4ml 培养基,轻轻吹打细胞层,把细胞层吹落,吹散。
3):取部分细胞悬液转移到新的培养皿中,添加适当的培养基,把细胞悬液打匀,于培养箱中培养。
4):注意培养基PH值变化情况,定期换液(每周2-3次),待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存。
(网络信息主针对网络推广作用,仅供参考,细胞培养请咨询细胞库管理员,以细胞库管理员提供给您的信息为准,操作前,如果有不明白之处,先咨询细胞库管理员,避免不必要的损失;)
布氏杆菌核酸扩增检测 PCR扩增:
取出BS–PCR MIX、Taq酶系,室温融化并振荡混匀后,10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照),每个测试反应体系配制如下表:
试剂:(BS–PCR MIX 24μl)(Taq酶系 2μl)
计算好各试剂的使用量,加入一适当体积洁净离心管中,充分混匀,10,000rpm离心10s,向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl,向每管中加入处理后样品(所获得的逆转录产物)或阴性质控品、BS阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍,记为1×10P6PCopies/ml,1×10P5PCopies/ml,1×10P4PCopies/ml)和阴性质控品4μl,10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内,按对应顺序设置阴性控品,阳性质控品以及未知标本,并设置反应体积(30μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM,淬灭基团为TAMRA)和循环条件:
ABI PRISM 7700,ABI PRISM5700,ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖),ABI PRISM7300/7500(使用8联管),MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器,循环条件:94℃→2分钟,后93℃ 30秒→55℃ 45秒,共40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器,循环条件:94℃→2分钟,后93℃ 5秒→56℃ 45秒,共40个循环。
结果判定:
测定结果的计算:
如果Ct值﹤38,则实验样品的BS DNA含量(基因拷贝数/ml)= Qty-Copies/ml;
如果38﹤Ct值﹤40,为灰区建议重新检测,重新检测若38﹤Ct值﹤40判为阳性,否则为阴性。
如果Ct值=40,则BS DNA含量(基因拷贝数/ml)﹤5×10P2PCopies/ml (低于检测下限)。