上海晶抗生物多重PCR试剂盒简介：

多重PCR试剂盒是一种在普通PCR基础上建立的一种可以同时扩增多个目的片段的检测多种细菌分子生物学的技术，其利用多对特异性引物同时扩增，提高了扩增效率，节省了成本。优点在于检测的速度快、准确性高和操作简单，特别适用于临床、环境和食品检测等领域。

原理：

多重PCR试剂盒快速检测通过碱基互补配对原则从而完成单链DNA的延伸工作，最终完成DNA双链的配对合成。

多重PCR与常规PCR的区别在于同一个反应体系中所加入的引物对数不同。多重PCR可以特异性扩增出多条目的DNA片段。反应体系的组成和PCR循环的条件需要经过优化以确保同时扩增多个DNA片段。理论上只要PCR扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但由于各种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量是有限的（～1000对）。

材料与仪器：

目的菌株，胰蛋白胨，细菌DNA提取试剂盒，LB液体培养基，LB固体培养基；PCR热循环仪，PCR扩增仪等。

步骤：

1. 引物设计：选择序列长度在500bp以上的基因设计引物。先用Primer软件，之后通过Oligo软件和BLASTN算法进行分析，选择二聚体少，自身不会形成发卡结构，Tm值在60℃左右且与非DNA同源性较低的引物作为该基因的特异性引物，并送公司进行合成。最好进行引物评价实验。

2. 提取目的菌株DNA：吸取样品匀液，5000r/min离心后弃去上清，参照细菌DNA提取试剂盒进行操作，提取样品的基因组DNA。

3. 测定DNA浓度及纯度：当260nm/280nm的比值在1.8-2.0之间表明提取的基因组DNA质量较好。

4. 多重PCR检测：将所提取的基因组DNA作为模板，以设计的引物（SU4,smal，clfA）进行多重PCR反应，25μL多重PCR反应体系为：2.5Μl10XPCRBuffer，1.0μLMgCl2（4mM），2.5μLdNTPMixture（各2.5mM），0.5μLTaq酶（5.0U），2.0μLDNA模板，引物（10umol），添加SU4,smal，clfA分别为2.6μL、0.5μL、1μL，ddH2O补足至25μL。

5. PCR反应程序为：①94℃5min；②94℃30s；③58℃30s；④72℃45s；⑤72℃10min。②-④步重复30次。

6. 配置1.5%琼脂糖凝胶，使用电泳检测多重PCR反应产物。

7. 在EB液中染色10~15分钟后置于凝胶成像仪下查看电泳条带结果。

注意事项：

1. 当比值大于2.0表明提取的基因组DNA中RNA含量较高，应加入一定量的RNase酶去除溶液中的RNA。

2. 目的片段长度不尽相同，而较小片段总是优先扩增；

3. 各对引物最佳PCR条件不相同，较长的片段需要较长的延伸时间。为了保证最终扩增产量的一致性，在优化反应条件的时候，尽可能选择有利于较大片段的扩增条件。

4. 多重PCR体系中，引物用量与扩增的目的片段长度有着正比内在关系，即扩增片段越长，所需引物相对越多，另外引物间的相互影响会导致扩增效果不佳。

5. DNA聚合酶的最适浓度为每25uL反应体积中添加2U，实际根据扩增效果进行轻微调整。

6. 高盐浓度会使长片段的扩增产物难于变性解链。因而长片段产物在低盐浓度下扩增效果较好，而短片段产物在高盐浓度下扩增效果较好。可以适当提高PCR缓冲液浓度，或者提高K+浓度至70~100mM。

7. 不同的细菌类型和样品类型可能需要不同的提取和扩增方法，需要根据具体情况选择合适的方法。同时在进行PCR试剂盒扩增反应时，需注意控制反应条件和减少污染，以确保准确性和可靠性。

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