毕氏酵母感受态细胞制备及转化
- 发布时间：2014/11/10 8:49:30
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1、毕氏酵母氯化锂转化法
（1）试剂
1MLiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）
50%PEG3350（SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）
2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
（2）感受态毕氏酵母的制备
接种Pachiapastoris到50mlYPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108Cells/ml）；
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；
重悬细胞于1ml100mMLiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；
离心机zui大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul100mMLiCl溶液中；
按50ul/管分装，立即进行转化；
注：不要将感受态酵母菌冰浴；
（3）毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
对于每一个转化，按以下顺序加入：
50%PEG3350240ul
1MLiCl36ul
2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul
5～10ug/50ulH2O质粒DNA50ul