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CCK-8 Frequently Asked Questions:

1. CCK-8与其他细胞增殖-毒性检测方法的优势在哪里？

2. 单孔接种多少个细胞？

当使用96孔板时，贴壁细胞的小接种量至少为1000个/孔（100μL培养基）。检测白细胞的灵敏度相对较低，因此建议接种量不低于2500个/孔（100μL培养基），建议先做几个孔摸索接种细胞的数量。若使用24孔板或6孔板，请先计算每孔相应的接种量，然后按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8。

3. 如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验（细胞毒性实验）时，还应考虑药物的吸收，可以在不含细胞、加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。

4. 哪些物质会影响CCK-8的测定？

当有还原性物质存在时会增加CCK-8的测定，增加OD值；当有氧化性物质存在时会抑制测定反应的发生，降低OD值。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。

5. 做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？

有时会有影响。如果药物具有还原性就会和CCK-8发生显色反应，增加OD值。解决方法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含药物的培养基（只加CCK-8）的吸光度高，则说明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。

6.   CCK-8对细胞的毒性大小如何？

CCK-8对细胞毒性相当低，同样的细胞在CCK-8检测后还可用于其他细胞增殖的检测实验，比如结晶紫检测法，中性红检测法或DNA荧光检测法等。由于每种细胞对CCK-8的耐受力不同，因此若需要长时间孵育，先检测下细胞在加入CCK-8后的活力。

7. 如果没有450nm的滤光片，还可以使用哪些其他滤光片？

还可使用430-490nm之间的滤光片，但450nm滤光片的检测灵敏度膏。

8. CCK-8能否对活细胞进行染色？

不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性四唑盐（WST-8），并通过电子载体1-methoxy PM将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上，因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的，不会进入细胞内，所以CCK-8不能对活细胞进行染色。

9.  须设定参比波长？设定参比波长的目的是什么？

不一定，CCK-8在参比波长处没有吸光度。设定参比波长的目的是为了去除由于样品浑浊产生的吸收。

10. 每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能存在以下几个原因：a）当在培养箱内培养时，培养板外一圈的孔容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。通常情况外一圈孔只加培养基，不作为测定孔用；b）有可能因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8，轻轻敲击培养板以帮助混匀；c）每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1000~100,000个/孔范围内摸索条件。

11. 如果OD值太低，可以采取什么办法？

可采取2种办法：a）适当增加细胞数量；b）延长加入CCK-8后的孵育时间。

12. 如果OD值太高，但不能减少细胞数量，如何解决？

可以缩短加入CCK-8后的孵育时间。比如，可以把加入CCK-8后的孵育时间由原来的3h缩短到2h。

13. CCK-8显色过程种如何终止反应？

有以下几种方法（96孔板）：a）显色反应后，将培养板置于4℃冰箱；b）每孔加10 μL0.1M的HCL溶液；c）每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反应终止后请在24h内测定OD值。

14. 必须预培养细胞吗？

不一定。如果需要保持细胞的加状态，建议预培养细胞。如果不做预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。有的科研人员不做预培养，但做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

15. 预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？

一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数板计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数板进行计数。

16. CCK-8对于不同的细胞灵敏度是否一样？

不一样。悬浮细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8后1-4h吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的染色时间或增加细胞数量来解决。

17. 悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。 

18. 应该每次做标准曲线吗？

建议每次都做。虽然细胞相同，但是细胞状态不一样。对于状态不一样的细胞建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能有轻微的差异，此时也建议分别做标准曲线。

19. 实验之前是否需要先检测以下培养基和CCK-8之间是否有反应？

建议使用一个孔做下检测，因有时培养基种可能含氧化还原物质。正式实验之前有必要先确认下培养基和CCK-8是否有反应。一般正常的OD值应该在0.4以下。

20. 有时在药物作用下，细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反应活细胞数量。如果细胞已经死亡，即使脱氢酶的活性还有，测定出来的细胞数量将会比真实值高，不能反应真实的活细胞数量，建议采用别的方法测定。

21. 可否使用384孔板进行实验？

可以。向每孔加入培养基总体积10%的CCK-8。如果加入CCK-8体积太少，可以先将CCK-8稀释一倍，然后加入培养基总体积20%的量。

22. CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？

有。但请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此，结果可能不同。

23. CCK-8能否检测细菌细胞？

可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向每孔100μL大肠杆菌培养液中加入10μL CCK-8，培养1-4h或过夜。

24. 如果加入药物中含有金属，是否有影响？

金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜分别会抑制5%、15%、90%的显色反应，使得灵敏度降低。如果终浓度是10mM，将会100%抑制。

25. CCK-8的稳定性如何？

CCK-8在2-8℃能稳定保存1年，推荐用此方法检测；长期不用也可置于-20℃稳定保存2年。

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