沪震生物教您养平滑肌细胞及内皮细胞
沪震生物教您养平滑肌细胞及内皮细胞
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血管内皮细胞不仅参与调节血管通透性和凝血过程，在免疫调节，移植排斥，肿瘤转移，炎症等许多过程中也具有重要作用。内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了内皮细胞分离及体外培养的方法。人脐带静脉是人血管内皮细胞zui易获取的来源，在人内皮细胞的研究中被普遍采用。
㈠ 原理在体外，内皮细胞在内皮细胞生长因子存在的条件下可迅速增殖，并可传代，可作为内皮细胞增殖，细胞因子分泌、表型等研究的模型。
㈡ 方法
1. 脐带内皮细胞的分离
试剂与器材
⑴ 胶原酶(Sigma)：I型((C-0130),用无血清RPMI 1640配成0.1％(W/V),分装、-20℃保存。
⑵ Cord Buffor：
1. 标本采集 在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带， 挤出脐带血管中的血液，放入装有含青*的PBS液瓶中，2h之内行脐静脉内皮细胞培养。
双抗：*100u/ml; *100μl/ml
PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸馏水中加入上述质量物质，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。
2. 原代血管内皮细胞的获取与培养 按Jaffe等人〔1〕的方法加以改进。在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS，冲洗两次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%*8～10ml，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的*注入50ml锥形离心管中，加入小牛血清2ml终止酶反应。再以30ml PBS冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000r/min离心10min，弃上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM(Dibco)？]培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液在*计数。zui后调细胞数，以1×105/ml接种至24孔培养板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃静止培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。
*溶液（100ml）配制：1）将D-Hanks（橙红色）液高压消毒灭菌，用NaHCO3液调节pH至7.2左右。 2）称取*粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。 3）次日先用滤纸粗虑，再过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱或－20℃保存备用，常用浓度为0.25％或0.125％；*溶液（深红色）偏酸，使用前用NaHCO3调pH至7.2左右。
D－Hanks液配制：
KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,
Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚红 0.02 g/L
3．传代内皮细胞的培养 原代内皮细胞融合后用培养液冲洗两次，然后用0.25%*加入到内皮细胞中，每孔0.3ml。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞皱缩、彼此分离或呈大片状分离即可终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按105个细胞/ml，继续培养。
4．血管内皮细胞的鉴定 1）倒置显微镜观察细胞的形态特点。2）VWF相关抗原免疫荧光检查：在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔中种植1ml含有105个细胞的原代或传代内皮细胞悬液。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，投入冷丙酮中(-18～-20℃)，细胞面向上，作用7min，用PBS冲洗3次，每次1min，而后进行间接免疫荧光检查，*抗体为鼠抗人VWF单克隆抗体(苏州医学院血栓室提供)，1∶20倍稀释，加入50μl于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时不加一抗做阴性对照。用PBS冲洗3次后，加入异硫氢酸标记的二抗50μl(异硫氰酸标记羊抗鼠IgG，北京)，放入37℃2h后，用PBS洗涤3次。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。 血管内皮细胞鉴定结果： VWF相关抗原间接免疫荧光检查，原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。
5．内皮细胞体外生长情况 用*消化的人脐静脉内皮细胞，接种在24孔塑料培养板各孔内4h后，大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，48～72h生长zui快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋祸状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于3～4d后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合，为单层呈铺路石状排列。
用dmem配0.2%的1型胶原酶[用20的血清的dmem配可能更好，有类似文献}，分装于*小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1并消化液中消化，消化约10几个小时{消化程度的把握要体会}，离心后，接种{若见细胞量大，成功把握大}，静置3天{没必要看，看多了无益}，8天可传代。