通蔚送你一本ELISA试验通关秘籍
时间:2020-09-29 阅读:289
试验原理:ELISA试剂盒的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶符号。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶符号的抗原或抗体既保存其免疫学活性,又保存酶的活性。
试验材料:抗原 ,血清,96孔酶标板 4℃冰箱 ,恒温培育箱 ,分光光度计。
试验步骤:
一、包被抗原
1. 用50mM 的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原,使抗原浓度为10-20 μg/ml,加100 μl/孔到96 孔酶标板,4℃放置过夜。
2. 第二天弃去包被液后,用PBST 洗刷3 次,每孔参加150 μl 1% BSA 37℃关闭1 小时。
3. PBST 洗刷3 次后,每孔参加100 μl 不同倍比稀释度的血清,并参加对照样品,37℃孵育2 小时。
4. PBST 洗刷5 次后,参加100μl 稀释后的HRP 符号的二抗,37℃孵育1 小时。
5. PBST 洗刷5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。
二、包被细胞
1. 在96 孔培育板上接种细胞数为1 x 104 cells/well,37℃过夜培育。
2. 第二天用PBS 洗刷培育板2-3 次。
3. 参加125 μl/well 10% Forma lin(1:10 稀释), 室温下固定15 min。
4. 用ddH2O 洗刷培育板3 次,并晒干,储藏在2-8℃备用。
5. 用PBST 洗刷3 次,每孔参加150 μl 1% BSA 37℃关闭1 小时。
6. PBST 洗刷3 次后,每孔参加100 μl 不同倍比稀释度的血清,并参加对照样品,37℃孵育2 小时。
7. PBST 洗刷5 次后,参加100 μl 稀释后的HRP 符号的二抗,37℃孵育1 小时。
8. PBST 洗刷5 次后,显色剂显色20 min 后,酶标仪上读取A405 吸收值。50mM 的碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃,保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至100 ml。
注:ABTS 作为底物进行显色反应(10ml):0.2M Na2HPO4 2.4ml;0.1M 柠檬酸2.6ml;ddH2O 5ml;ABTS 5mg;H2O2(30%) 4 ul(用前参加)。
注意事项:血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质部分浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,防止气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价下跌,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少数分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可参加适当防腐剂。
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