这年头，做科研的不会做ELISA实验，都不好意思出门。做ELISA实验容易，想要做好ELISA实验还是有点难度的！求助，做ELISA实验老是失败怎么办？今天恒远生物小编为大家总结ELISA实验经验，让大家避免掉入“坑”里，以后的ELISA实验必定是一路绿灯！

酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。

一、ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA实验中有三种必要的试剂：

① 固相的抗原或抗体（用于结合到固相载体上）

② 标记的抗原或抗体（标记物）

③ 作用的底物（显色剂，用于显色）

二、ELISA实验成功七要素：

①成功采集到样品

②样品保存妥当

③成功复温样品，确保没有降解

④试剂盒质量没问题

⑤成功做出标准曲线

⑥操作过程没有出现差错，编号没有混乱

⑦显色之后颜色明显，且在检测范围之内

三、四种常见ELISA方法

1.直接ELISA

将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直检测抗原。

相较于其它类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA板结合，实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

2.间接ELISA

先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。

3.夹心ELISA

先将捕获抗体固定于ELISA板孔中，然后加入样品，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；如果检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

夹心ELISA的灵敏度高，它比直接或间接ELISA敏感2-5倍；同时夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，灵活性较高。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。

4.竞争ELISA法

预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。

竞争ELISA相对以上介绍的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式。其主要优点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。

四、ELISA常见问题与解决方法

1. 阴性对照出现阳性结果

① 样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。

② 酶标板洗涤不*——洗板前先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充分洗涤。

③ 抗体量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用抗体，稀释抗体到适当浓度。

2．酶标板整体背景高

① 抗体非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合。

② 底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。

③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应，适当缩短显色时间。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的，若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液。

⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。

3. 复孔之间重复性差

① 样品数量不整齐，加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第一次接近。

② 加样量不一致——样品稀释前应充分混匀，并且使用同一移液枪。

③ 洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时，操作条件、人员应尽可能与上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量。

② 加入抗体量不合适会造成结果偏低或偏高——使用建议抗体量或为了使结果更好尽可能调整抗体的适用量。

③ 孵育时间太短导致检测结果偏低——适当延长抗体或抗原的孵育时间，确保待测样品与检测抗体能充分结合。

④ 孵育温度不适合——应保证抗体在适宜条件下进行孵育（一般37℃孵育1h）。