【原理】

ELISA双抗体夹心法的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。现上海恒远生物科技有限公司技术以检测HbsAg为实例为您详细讲解。

【材料】

酶标抗体（HRP-抗HBs-IgG）、抗HBs-IgG、待检血清

包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB

稀释液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液

底物液 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4?12H2O 35.8 g/L）5.14 ml，0.05 mol/L枸橼酸（10.5g/L）4.86 ml混匀，加入邻苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，临用时加30% H2O2 4.0μl，混匀。

终止液 2 mol/L H2SO4

温箱、酶标反应板、酶标分光光度计

【方法】

1． 包被 取包被液适当稀释的抗HBS-IgG 0.1 ml，加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖，4℃ 24h。次日用洗涤液充分洗涤3次，甩干。

2． 各孔内加不同稀释倍数的待检血清0.1 ml，同时加阳性和阴性对照血清，置43℃温箱60 min，移去液体。同前法洗涤3次，甩干。

3． 各孔内加稀释HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干。

4． 各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min。

5． 各孔内加2 mol/L H2SO4 0.05 ml，终止反应。

【结果】

1． 目测法 阳性孔呈桔黄色，阴性孔无色或极浅黄色。

2． 比色法 用酶标分光光度计测A492nm，计算P/N值（为待测血清A492nm和阴性对照A492nm的比值）。如P/N2.1，结果为阳性，否则为阴性。

ELISA简便、敏感、特异。并酶标记抗体试剂制备容易、稳定、有效期长、因此推广很快，ELISA双抗体夹心法，但仅适用于二价或二价以上的大分子抗原的检测。