今天上午，有位来自沈阳的于老师在我公司侧面的在线客户中咨询问题。于老师主要咨询的问题是：

    做ELISA间接法测试小鼠血清中的IgE抗体，设空白对照、和阴性对照、阳性血清稀释倍数为5千、1万、10万、20万不等，用的是生物素标记的羊抗鼠IgE抗体，和亲和素的辣根过氧化物酶，可是结果出来后除了空白对照孔没有颜色外，其余各孔全有颜色，而且OD值都相差不大，开始以为是污染可是连续重复N遍后结果还是这样，而且发现凡是有用抗原包被过孔全都呈现阳性，难道真的是污染造成的吗？如果真的是污染那为什么各个孔的OD值都很平均呢？为什么我测IgG就呈现良好的梯度呢？（注明：我测IgG用的是普通的二抗和辣根过氧化物酶，不是生物素的二抗和亲和素的辣根；另外我是手工洗板，每次甩完板后在滤纸上拍干）

    是不是生物素二抗和亲和素辣根过氧化酶过于灵敏造成的污染呢？请教高手指点，如果是污染该怎样避免呢，请指教！（实验室没有洗板机）我已经做了快10天了用尽了办法都是这样，实验又要赶进度，每天都在做无用功……

    吴收到后，*时间将问题内容转述给了公司技术员，上海恒远技术员分析道，你以前测IgG有良好的梯度，而现在测IgE梯度不明显，它们的差别在于测IgG是用HRP标记的二抗，而测IgE用生物素标记的二抗。在排除你的ELISA操作不熟练出现问题的情况下，您可以考虑以下因素：

    1.是否是生物素标记的二抗有问题？是进口货还是国产货？检验生物素标记的二抗有无问题，可以将二抗稀释成不同浓度，然后用底物使之显色，简单的说就是给二抗做个方阵，看看它的显色及灵敏度；

    2.你一抗稀释的zui大倍数是多少倍？你做方阵时，可以把一抗稀释的梯度拉大一些，如果现在做到20万倍稀释，还可以继续往下，比如40万、80万、160万……因为如果一抗的浓度非常大，效价很高的话，那么肯定是需要稀释到很大的一个倍数后显色才会有明显梯度出现。

    3.你的空白孔有没有包被抗原？如果包被抗原了，但结果不显色则说明你的包被封闭等操作都没问题；如果没有包被抗原直接封闭的，zui后不显色，那说明二抗没有什么非特异性吸附。

    4.如果阴性对照也显色，那抗原的用量可能比较大了，再往下稀释。

    5.洗板也要注意，尽量勿加满孔，小心串孔。

    经过一系列分析解答之后，我公司技术员还表示：ELISA是很粗略的又很灵敏的体系，实验结果需根据操作情况来分析原因。