逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

实验步骤：

一、总 RNA 的提取

按照总 RNA 提取实验步骤提取组织或细胞中的总 RNA。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

在 0.5 ml 微量离心管中，加入总 RNA 1～5 μg，补充适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，轻轻混匀、离心；

70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2～5 min；

加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

于 70℃ 加热 15 min 以终止反应；

将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20 ℃ 保存备用。

三、PCR

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；

加入适量的 ddH2O，使总体积达 50 μl。轻轻混匀，离心；

设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28～32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；

电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。