Ultrasense® ECL化学发光底物试剂盒使用说明书
时间：2011-09-21 阅读：2795
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上海研晶生化试剂有限公司 -
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| 产 品 | 名 称 | 规 格 |
| 试剂A | 发光剂/增强剂溶液 | 25ml |
| 试剂B | 过氧化物缓冲液 | 25ml |
组成：
产品简介：ECL化学发光底物是免疫印迹实验中与辣根过氧化物酶（HRP）配套使用的高灵敏度检测试剂。本品在HRP的催化下发生化学发光反应，用于检测固定在PVCF膜上的蛋白质、DNA等生物大分子，能够检测到10-15g水平的抗原；发出的光强度强烈而持久，可以用照相技术（X-光胶片曝光）、凝胶成像仪等方法显示、检测。
保存条件： -4℃避光保存，保质期二年。
操作步骤：
1. 按照常规细胞破膜、提取蛋白、电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育后，充分洗涤印迹膜。
2. 根据需要量，新鲜配制发光工作液：取等体积的A 溶液B溶液混合均匀，立即使用。
3. 从洗涤液中取出印迹膜，在滤纸上沥净洗涤液。将膜浸入发光工作液中，并与之充分接触。室温孵育 2—5分钟。
4. 从发光液中取出印迹膜，用滤纸沥去多余的发光工作液。
5. 在 X-光胶片暗盒内面铺一张面积大于印迹膜的塑料保鲜膜。将杂交膜紧贴保鲜膜，去除气泡和皱褶。
6. 在暗室内将印迹膜压在X-光胶片上，曝光不同的时间，如数秒到数十分钟。显影冲洗。
注意事项：
1. 为获得*实验结果，请务必优化实验条件，包括检测样品的用量、一抗、二抗稀释度以及杂交膜及封闭试剂的选择；建议一抗的工作浓度为50ng/ml—1μg/ml，二抗为5ng/ml—50ng g/ml。
2.由于牛奶中含有内源性*，在使用亲和素/*系统时，封闭液中请避免使用奶粉；
3.在封闭缓冲液及所有抗体稀释液中加入高质量的吐温-20 （终浓度为0.05 ％），以减
少非特异性结合；
4.由于叠氮钠是HRP抑制剂，在缓冲液中避免使用叠氮钠作为防腐剂；
5.整个免疫印迹实验过程请确保印迹膜始终处于湿润状态，避免干燥；
6.为获得*实验效果，抗体孵育及膜洗涤步骤中请使用摇床辅助完成；
7.避光条件下，配制好的化学发光工作液在室温下可稳定8小时。阳光或其他强光会影响工作液的效果。为获得*效果，可于棕色瓶中配制工作液。正常实验室灯光短时间照射不影响工作液的使用。
8.蛋白过量或长时间曝光，将加深背景并使条带强弱变化而失去线性关系。曝光不足则使条带模糊。
9.发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。高丰度蛋白条带发光较强，在暗房中肉眼可见。低丰度蛋白条带发光较弱，肉眼不可见，但可使X光胶片曝光。因而不能以肉眼观察结果判断发光时间。有时候弱带需要曝光1—10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，重新ECL发光和曝光。
10. 某些市售保鲜膜包裹印迹膜时会使荧光淬灭，应选择高质量保鲜膜。
可能出现的问题及解决方法：
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
| 胶片反相（白色条带，黑色背景） | 系统中HRP过量 | 稀释HRP标记物至少10倍以上 |
| 膜上出现棕色或黄色条带 | ||
| 暗室中看到强烈发光 | ||
| 发光信号持续时间过短 | ||
| 信号较弱或者无信号 | 发光反应系统中HRP过多，消耗底物过快，引起信号迅速降低 | 稀释HRP标记物至少10倍以上 |
| 抗原/抗体量不够 | 增加抗原/抗体使用量 | |
| 蛋白转移率低 | 优化转移系统 | |
| 高背景 | 系统中HRP过量 | 稀释HRP标记物至少10倍以上 |
| 封闭不足 | 优化封闭程序 | |
| 封闭试剂选择不当 | 选择另一种封闭试剂 | |
| 冲洗不充分 | 增加冲洗时间，次数 | |
| 曝光过度 | 减少曝光时间 | |
| 抗原/抗体浓度过高 | 降低抗原/抗体使用浓度 | |
| 蛋白条带为点状 | 蛋白转移失败 | 优化转移过程 |
| 膜未平衡 | 按照说明书处理膜 | |
| X-光胶片与膜之间有气泡 | 曝光前去除所有气泡 | |
| 出现非特异条带（信号维持时间较短，高背景） | 系统中HRP过多 | 稀释HRP标记物 |
| 出现非特异条带（信号维持时间正常，背景干净） | 一抗用量过多 | 进一步稀释一抗 |
| SDS导致非特异结合 | 在实验过程中避免使用SDS |