大鼠肿瘤坏死因子α试剂盒实验原理

实验原理
大鼠肿瘤坏死因子α试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。

操作步骤

1. 标准品的稀释：大鼠肿瘤坏死因子α试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
360ng/L 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
180ng/L 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
90ng/L 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
45ng/L 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
22.5ng/L 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   
4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5. 洗涤：大鼠肿瘤坏死因子α小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。