培养基NK细胞的制备研究

1.NK 细胞的制备

　　1）制备NK 的方法参见*章之第四节。

　　2）悬浮NK 于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。

2.培养基接种NK 细胞

　　1）制备饲养细胞（PBMC）方法参见*章*节。

　　2）于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。

　　3）被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。

　　4）用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×106/ml。

　　5）在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×108 个饲养细胞）。

　　6）将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。

　　7）将NK 细胞悬浮于接种培养基液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。

　　8）将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。

3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞）

　　1）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。

　　2）每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106 细胞/ml）的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：

　　（1）融化饲养细胞，移至50ml 试管中。

　　（2）轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。

　　（3）用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。

　　（4）按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。

4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。

5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。

6.分离克隆（11－15 天）

　　1）当培养基液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔，2 孔分为4 孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。

　　2）在96 孔板上扩增克隆，并重复第7 天的操作。