研生试剂-细胞融合

细胞融合的步骤：

    1.制备饲养细胞层  一般选择小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同晶系的小鼠，常用BALB／C小鼠，6～10周龄

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拉颈处死，浸泡在75％乙醇内，3～5min

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用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

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用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)

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反复冲洗，吸出冲洗液

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冲洗液放人10ml离心管，1 200r／min／分离5～6min

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用20％小牛血清或胎牛血清的培养液混悬，调整细胞数至lXl0‘／ml

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加入96孔板，100ul/孔

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放人37℃C02孵箱培养

    2．制备免疫脾细胞  

zui后一次加强免疫3d后小鼠拉颈处死

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无菌取脾脏，培养液洗1次

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脾脏研碎，过不锈钢筛网

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离心，细胞用培养液洗2次

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计数

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取脾淋巴细胞悬液备用

    3．制备骨髓瘤细胞

般选用小鼠腹

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取对数生长期骨髓瘤细胞离心

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用无血清培养液洗2次

4.融合

    (1)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50m1离心管中用无血清不*培养液洗1次，离心，l 200r／min，8min；弃上清液，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

    (2)90s内加入37℃预温的1m1 45％PEG(分子量4 000)溶液，边加边轻摇。37℃水浴作用90s。

    (3)加37℃预温的不*培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

    (4)离心，800r／rain，6min。

    (5)弃上清液，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。

    (6)将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孑L板内，每孔加100tzl。一般1个免疫脾脏可接种4块96孔板。

    (7)将培养板置37℃、5％CO：培养箱中培养。

    细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。然后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有3个问题应特别注意，①细胞比例，骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1：2到1：10不等，常用1：4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4。5ml培养液；间隔2rain滴加5ml培养液，然后加培养液50ml。③培养液的成分，良好的培养液对融合细胞尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。