进口分装ELISA试剂盒PCR方法技术分析

(一)试剂

(1)引物:决定扩增的特异性。进口分装ELISA试剂盒根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生

物都有自己特异的引物。

(2)耐热的DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。

(3)10×PCR缓冲液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。

(4)5mmol/L dNTP贮备液:将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度用UV吸收法测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。

(二)操作程序

过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下:

(1)向一微量离心管中依次加入

DNA模板 102-105拷贝

进口分装ELISA试剂盒引物 各1μmol/L

dNTP 各200μmol/L

10×PCR缓冲液 1/10体积

ddH2O 补到终体积(终体积50μl-100μl)

混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

(2)加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。

(3)冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

(4)PCR的循环程序为:94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。zui后一次循环结束后，进口分装ELISA试剂盒再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。