ELISA试剂盒属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。
如果对试剂准备不太注意，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题影响后面的操作。测定中试剂的准备zui为关键的是，在实验开始前

1.将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20min以上后，以使试剂盒       
2. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
3. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
4. 一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
5. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
6. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定。
7. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，ELISA试剂盒不能混淆。
8. 底物请避光保存。
9、控制好每一步的操作时间。
ELISA试剂盒在使用前与室温平衡，再进行测定。在中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA试剂盒中似不恰当。