一、核酸探针标记

    核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。

    核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针；根据标记物不同，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。ELISA试剂盒

(一)切口平移法(nick translation)标记双链DNA探针

    当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3?蒺羟基末端。同时该酶具有从5?蒺→3?蒺的核酸外切酶活性，能从切口的5?蒺端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3?蒺端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。zui合适的切口平移片段一般为50～500bp。切口平移反应受几种因素的影响：① 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度；② DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小；③ DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。

1.材料

（1） 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

（2） 试剂： ①10×切口平移缓冲液：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.2)；0.1mol/L MgSO4；10mmol/L DTT；100μg/ml BSA。②未标记的dNTP原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，浓度为0.3mmol/L。③[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP 400 Ci/mmol, 10μCi/μl。④ E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4U/μl)溶于50μg/ml BSA，1mmol/L DTT，50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。⑤DNA酶Ⅰ1mg/ml。⑥EDTA 200mmol/L(pH8.0)。⑦10mol/L NH4Ac。

2.方法

（1）按下列配比混合：未标记的dNTP 10μl、10×切口平移缓冲液5μl、待标记的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至终体积 50μl；

（2）置于15℃水浴60min；

（3）加入5μl EDTA终止反应；

（4）反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L，加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。

3.注意事项

（1）3H、32P及35S标记的dNTP都可用于探针标记，但通常使用[α-32P]-dNTP。

（2）DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。

（二）随机引物合成法

    随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400～600个，可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。反应产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg探针。随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。ELISA试剂盒

1. 材料

（1）设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。

（2）试剂：①随机引物（随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA）。 ②10×随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6)；10mmol/L MgCl2。③Klenow片段。④20mmol/L DT。⑤未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。⑥[α-32P] dATP：比活性3000Ci/mmol，10μCi/μl。 ⑦缓冲液A：50mmol/L Tris·Cl（pH7.5）、50mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA（pH8.0）、0.5% SDS。

2.步骤

（1）200ng双链DNA(1μl)和7.5ng随机引物(1μl)混合后置于Eppendorf管内，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。

（2）与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管内混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未标记的dNTP溶液 1μl、10×随机标记缓冲液 1μl、[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。

（3）将步骤(1) Eppendorf管中的溶液移到步骤（2）管中。

（4）加入5U(约1μl) Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12 000g离心1～2s，使所有溶液沉于试管底部，在室温下保温3～16h。

（5）在反应液中加入10μl缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在-20℃下备用。同时计算放射比活性。

3.注意事项

（1）引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之，则可获得较长片段的探针。

（2）模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%。

（三）光敏生物素标记方法

    光敏生物素是一种化学合成的生物素衍生物。其分子中含有可光照活化的叠氨代硝苯基。醋酸盐易溶于水，在水溶液中光敏生物素醋酸盐与待标记核酸混合，在强可见光短暂照射下即能与核酸的碱基反应，生成光敏生物素标记核酸探针。一般在规定条件下，核酸中每100～150bp可结合一个生物素。这种生物素标记的探针不会影响探针序列与其互补和新的靶序列之间的杂交。该标记方法的优点是简便易行，单、双链DNA和RNA都能以此法标记形成稳定的共价结合，且生成的标记探针为橙红色，便于观察反应结果。此法标记的探针可检出0.5pg滤膜结合DNA。此外，标记探针稳定性好，-20℃可保存12个月。

1.材料

（1）仪器　LYQ 12～100卤钨灯、台式离心机。

（2）器皿　微量移液器、Tip头，光标用冰模、墨镜、尺子。

（3）试剂　①光敏生物素醋酸盐为白色干粉，分子量为533。在暗室中用灭菌双蒸水溶解，使成1mg/ml。小量分装，避光下-20℃可稳定保存4～6个月。②仲丁醇或正丁醇。③TE缓冲液100 mmol/L Tris·Cl(pH 9.0)1 mmol/L EDTA。④无水乙醇、70％乙醇。⑤3 mol/L醋酸钠(pH5.2)。⑥0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)或灭菌dH2O。

2．方法

（1）强光源照射标记：在暗室安全灯下，向微量离心管中加入15μg待标记核酸(DNA或RNA)，15μg光敏生物素并混匀。将反应管敞口插入冰模中，液面距光源10cm，用LYQ 12-100卤钨灯光照标记30min。加入70μlTE缓冲液。此后操作在正常光线下进行。

（2）仲丁醇提取：加入100μl(等体积)仲丁醇(或正丁醇)，充分混匀，4000g离心2min。吸弃上相，加入等体积仲丁醇(或正丁醇)重复萃取一次。

（3）乙醇沉淀浓缩：吸弃上相，计量下相(溶液可浓缩至40μl左右)。加入1/10体积3mol/L的乙酸钠(pH5．2)和2倍体积冷无水乙醇，混匀。-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀1h以上。以4℃10 000g离心15min。弃上清，再用100μl 70％冷乙醇以4℃ 10 000g离心15min。离心洗涤沉淀(注意勿将沉淀吹散)。

（4）标记核酸的保存：真空干燥或室温风干标记沉淀物，将其溶于适量0.1 mmol/L EDTA溶液或灭菌双蒸水中。适量分装后-20℃避光保存备用。

3.注意事项

（1）避光下准备反应体系：由于光敏生物素醋酸盐对光敏感，应避免光照。在分装试剂及核酸与光敏生物素混合时应在暗室安全灯下操作。

（2）核酸纯度：由于光敏生物素能与任何有机物反应，因此用做标记探针的核酸要高度纯化。用作标记探针的核酸不用Tris溶液溶解，Tris中所含氨基会干扰标记。

（3）光照标记时间：光照时间不应太长。如果核苷酸上标记光敏生物素过多，会因空间位阻而影响探针与靶序列的杂交。一般认为，每100～400bp标记上一个光敏生物素分子。此法适用于大于200bp的核酸片段的标记，小片段标记率不高。ELISA试剂盒

（4）光敏生物素用量：光敏生物素的活性基团是碱基，反应中加量不能太多，否则会产生氮气泡。一般为1 μg DNA用1～2μg光敏生物素。