荧光素标记试剂与酶标试剂

(1)酶标试剂：酶标抗体仅需适当底物和普通光学显微镜即可高度敏感地检出抗原。由于信号是通过吸收光的差异，而非发射光来检测，底物的不溶性显色产物分布在酶所在位置的周围区域，因此这种检测方法尚不能达到荧光技术的分辨率。

    酶反应后出现沉淀，在酶所处位置周围产生不溶性显色产物，通过底物的显色来检出酶标试剂所处位置。多种酶及底物可供选择，但近年来多选用辣根过氧化物酶(HRP)及底物二氨基联苯胺(DAB)来进行培养细胞的染色。

    多种试剂已经商品化，其价格便宜，且具有较好的质量。HRP可与抗Ig抗体、蛋白A、蛋白G、亲和素或链霉亲和素等共价偶联，其中任何一种二级试剂均可用于检测与目标抗原结合的一抗的位置。

(2)荧光素标记试剂：这种检测方法中，样品置于特定波长的光波下进行检测。荧光染料的电子吸收合适波长的光波后达到较高能量状态，当其再回到基础状态时，即发射出特定波长的光波。这种发射光形成了在显微镜下所看到的荧光。

    由于样品中荧光染料被激发后发出的荧光集中于一点，因此运用荧光标记所获亚细胞结构的分辨率较透射显微镜更高。例如，应用此法在荧光显微镜下可观察到直径为5nm的细胞中纤丝结构。这就超过了的光学显微镜的分辨率。这种方法在敏感性方面的主要缺陷由于荧光染料在暴露于激发光后短时间猝灭所造成的相对弱的发射光，因此，此法传统上用于浓度较高抗原的检测。然而， 由于荧光染料及共聚焦扫描显微镜、高灵敏度照相机等图像分析系统的出现，这个领域的发展极为迅速。

    各种荧光染料具有不同的激发及发射光谱。安置滤光镜能够确保只有正确波长的激发光通过以便激发样品产生荧光。在观察光路上安置第二套滤光镜使得仅由荧光染料激发产生的发射光才能通过，这样，观察到的是一个仅由发射光形成的图像，而背景是黑色的，这种图像的分辨率很高。

    由于某些荧光染料的发射光谱并不重叠，同一样品可同时采用2种荧光染料进行观察。这样能够同时检测同一样品的2种不同的抗原，甚至能够研究其在亚细胞结构上的分布不相同。常用的荧光染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗达明和得克萨斯(Texas)红等。

细胞染色常用染料的特性

    检测荧光标记的试剂需要一个特殊的显微镜，有两种显微镜可供选择：荧光显微镜较为便宜，约2万～5万美元。若细胞染色中产生的荧光强度较弱，则须配置epifluore—science装置，以使激发光通过物镜照射在样品上。用于免疫荧光检测的第二种显微镜是共聚焦显微镜， 目前市面上有几种共聚焦显微镜，价格在10万～40万美元之间。其原理是用高度聚焦的光线在不同的焦平面上照射样品，从而激发样品产生荧光，再从各个焦平面来观察样品，经数字化处理后形成图像，这样能够得到细胞的各个子面图像，并且通过合成得到整个细胞的图像。这两种显微镜均能够良好地应用于细胞染色。

(3)荧光素与酶：两种细胞染色法均实用。如果实验要求操作简单，用同一条件观察大量样品，用酶联检测法较好；如实验要求高分辨率，则应用荧光素标记检测法；共聚焦显微镜比相差显微镜具有更高的分辨率。如考虑敏感性，选用共聚焦显微镜法，再依次为酶联法及荧光显微镜法。如考虑到价格因素，则酶联法为。抗体