磺胺三合一检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）
 
1 磺胺三合一检测试剂盒原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测组织、血清、蜂蜜、牛奶、尿液等样本中的磺胺类药物（Sulfonamides，SAs），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的磺胺类药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗磺胺类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含磺胺类药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中磺胺类药物的残留量。

2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.2ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃，45min～15min
2.3 检测下限：
组织（高检测限方法）……………………0.2ppb
组织（低检测限方法）……………………2ppb
血清、尿液、鸡蛋………………………0.8ppb
蜂蜜………………………………………0.2ppb
牛奶………………………………………4ppb
饲料………………………………………8ppb
2.4 交叉反应率：
药物名称
交叉率
灵敏度
磺胺甲基异噁唑（SMZ）
100%
0.2ppb
磺胺间甲氧嘧啶（SMM）
67%
0.3ppb
磺胺嘧啶（SD或SDZ）
33%
0.6ppb
 2.5 样本回收率：
组织、蜂蜜、鸡蛋………………………………85±25%
尿样、牛奶、血清、饲料………………………80±25%

3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准液：各1ml
0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb
高标准液（红盖）：1ppm…………1ml
酶标记物（红盖）…………………5.5ml
抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
2X复溶液（黄盖）…………………50ml
说明书………………………………1份

4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、浓HCl、NaH2PO4·2H2O 

5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：0.1M  磷酸盐缓冲液
    称取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去离子水1000ml溶解。
配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液
    取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中，混匀。
配液3：0.5M盐酸溶液
    4.3ml浓HCl加入去离子水定容至100ml混匀。
配液4：0.2M  NaOH溶液
    0.8gNaOH用去离子水100ml溶解
配液5：复溶液
    将2×复溶液用去离子水2倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 组织样本（高检测限）处理方法
1）称取2±0.05g均质组织样本置离心管中，加入1ml 0.1M磷酸盐缓冲溶液，用涡旋仪涡动样本成糊状，加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液，振荡2min，室温4000r/min以上离心5min；
2）移取4ml上层清澈有机相至干燥容器中，在50-60℃氮气或空气吹干；
3）加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，加入样本复溶液1ml。振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min；
4）去除上层正己烷，取50µl下层水相用于分析。  
    样本稀释倍数：1    检测下限：0.2ppb
5.3.2 组织样本（低检测限）处理方法
1）称1.0±0.05g 均质组织样本于离心管中；加入9ml 0.1M 磷酸缓冲液，震荡5min，室温4000r/min以上离心5min； 
2）取50µl上层液体用于分析。
    样本稀释倍数: 10    检测下限：2ppb  
5.3.3 鸡蛋样本处理方法
1）用均质器均质鸡蛋样本，使蛋清和蛋黄充分混合；
2）称取2.0±0.05g均质后的鸡蛋样本（蛋粉1g加3ml去离子水混匀后取2ml相当于2g鲜鸡蛋）至50ml离心管中，加入8ml乙腈，立即用振荡器振荡10min，室温4000r/min以上离心5min；
3）移取1ml上清液至10ml洁净干燥玻璃试管中于，在50-60℃氮气或空气吹干；
4）加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s溶解干燥的残留物，再加入1ml复溶工作液，用涡旋仪涡动1min，室温4000r/min以上离心5min；
5）去上层有机相，取下层水相50ul用于分析。
    样本稀释倍数: 4    检测下限：0.8ppb  
5.3.4 血清样本处理方法 
1）将血样本于室温放置30min，室温4000r/min以上离心10min，分离出血清或过滤血清；
2）取1ml血清，加入3ml 0.1M PB缓冲液混合，混合30s；
3）取50µl用于分析。  
    样本稀释倍数：4    检测下限：0.8ppb
5.3.5 蜂蜜样本处理方法
1）称取1±0.05g蜂蜜样本于50ml离心管中，加入1ml 0.5M盐酸置于37℃环境中30min；
2）加入2.5ml 0.2M 氢氧化钠 (将PH值调至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振荡5min，4000r/min以上室温离心5min；
3）取2ml上层液体于50℃下氮气吹干，加0.5ml 已稀释好的复溶液复溶，混合30s；
4）取50µl用于分析。  
    样本稀释倍数：1    检测下限：0.2ppb
5.3.6 尿样本处理方法
1）用3ml 0.1M PB缓冲液与1ml经离心后的清亮尿样本混合，混合30s； 
2）取50µl液体用于分析。  
    样本稀释倍数: 4    检测下限：0.8ppb 
5.3.7 牛奶样本处理方法
1）取100ul牛奶样本用0.1M PB缓冲液按1︰19（v/v）稀释（即100ul牛奶+1.9ml 0.1M PB缓冲液），混合30s；
2）取50µl用于分析。  
    样本稀释倍数：20    检测下限：4ppb     
5.3.8 饲料样本处理方法
1）称取2.0±0.05g饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙腈，振荡5min，室温4000r/min以上离心5min；
2）移取1ml上层有机相至10ml洁净干燥玻璃试管中，在50-60℃氮气或空气吹干；
3）加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入1ml 0.1M磷酸盐缓冲溶液，用涡旋仪涡动30s混匀，转入2ml聚苯乙烯离心管中，室温4000r/min以上离心5min；
4）除去上层有机相，移取100ul下层水相至2ml离心管中，加入 900ul 0.1M磷酸盐缓冲溶液，用涡旋仪涡动1min，混匀；
5）取50ul用于分析。
   样本稀释倍数：40    检测下限：8ppb

6 酶联免疫试验步骤
    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应45分钟。
6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。
6.5 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.6 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算
    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）

8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的*性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。