做过原代细胞的人都知道，实验看似容易，但真想把结果做漂亮，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。很多人刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，终结果未能达到预期的效果。就来给大家分享下原代细胞实验中会会遇到的问题以及经验总结。

一、石蜡切片和冰冻切片的区别是什么？

 1.冰冻切片常用于手术中的快速病理诊断，优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做原代细胞时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。

2.石蜡切片广泛应用于常规制片，优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温长久保存。缺点是步骤繁多，需要抗原修复。

3.抗体应用中能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是能做石蜡切片的，可同时做冰冻切片。

二、如何才能充分脱蜡？

 1.蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须脱蜡，原代细胞目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；

2.脱蜡的时间要灵活调整。如果在夏天，室温较高，则脱蜡时间不需很多，3-5 min 就已足够。如果在冬天，室温较低，则脱蜡时间需要延长，10-20 min 或更长。

3.当天切的切片，烤 2 小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温 10-20 min，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果会更好。

三、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么？

1.一般 3% 过氧化氢灭活时间短点，可以避光 10 min；而 0.3% 过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 10-30 min。

2.用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 好，能更好保护抗原和固定组织，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。

3.现用现配，配好后 4ºC 避光保存。

四、苏木素复染时间如何把握？

1.苏木素复染时间要根据温度，试剂新旧和目标物的定位变动，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。对于细胞核定位的指标，减少苏木素染色时间。

2.盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（动作一定要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

3.如果分化的颜色过浅，可以复置于苏木素中染色。

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