液氮超低温保藏程序

1、容器的选择：使用带螺旋盖的2ml塑料安培瓶。

2、检查安培瓶是否渗漏：用0.05%的亚甲基蓝水溶液在4℃浸泡30-45分钟，冲洗干净，弃去含有蓝色染料的安培瓶，其余的安培瓶备用。

3、打印标签（激光打印）。

4、容器的灭菌：先用蒸馏水漂洗干净安培瓶，再用蒸馏水在灭菌锅中121℃浸泡灭菌15分钟，干燥并将打印好的标签放入安培瓶中，略拧紧螺旋盖，再行121℃灭菌30分钟。

5、保藏菌菌龄：处于zui大生长量阶段或对数生长期后期。

6、保护剂：选用5-10%的甘油或二甲基亚砜作保护剂。

1）甘油的准备：在121℃灭菌15分钟，2-8℃贮存。甘油一般以两倍zui终所需浓度的水溶液保存，然后与同等量的细胞悬液混合。若不用细胞悬液，则以zui终所需浓度的水溶液保存。

2）二甲基亚砜：用0.22um的聚四氟乙烯过滤膜过滤除菌。过滤膜预先用甲醇和二甲基亚砜漂洗。无菌的二甲基亚砜以10-15ml装量2-8℃避光保存。

7、分装：在无菌条件下，将细胞悬液（从平板上打下直径为5cm的菌块）分装于安培瓶中，并注入保护剂，拧紧螺旋盖。

8、将安培瓶固定在铝夹上，贴好标签。为了便于取用，一般一个铝夹上仅放一个菌株。

9、将控温系统先预冷到4℃，再将铝夹放入其中。以每分钟1℃降温至-40℃，然后以每分钟10℃降温至-90℃。降温以后，将铝夹转移至处于液氮中的储存器中保存。