● 本文从光合生理研究入手，辅以技术设计考虑，最后以一个实际应用案例的数据展示其结合应用的优势。该研究案例首先使用LI-600筛选对水分胁迫敏感的野生辣椒品种，再结合使用LI-6800针对筛选出的品质进行深入生理指标研究。LI-600的高通量筛选功能在此得以展现，在一天内使用一台LI-600测量了500多片叶片样本，通过这个大样本量调查数据筛选出目标个体，再使用LI-6800做进一步深入全面的植物生理指标分析评估。

● 在线研讨会通知

时间：2021年9月29日 上午10:00-11:00 （场）

对应北京时间9月29日（星期三）晚11:00-12:00

         2021年9月29日 下午08:00 （第二场）

对应北京时间9月30日（星期四）早09:00-10:00

主讲人：Jason Hupp

主持人：Rod Madsen

在线答疑应用科学家：Cici Hall和Ian Smillie

报名入口

文 | 许燕 刘美玲

图片来源 |  LI-COR公司

LI-600荧光气孔测量仪（点击了解更多）

■ 摘要

LI-600荧光气孔测量仪是为快速采样而设计的。它能快速测量叶片的气孔导度和叶绿素a荧光参数。而LI-6800便携式光合作用系统则突显于提供更全面、深入、系统的数据。相对于LI-600只针对气孔做相关参数的快速测量，LI-6800测量参数更多（如碳交换相关参数等），需要花费的时间也更多。虽然LI-600和LI-6800有不同的用途，但它们提供的数据具有很强的互补性。当它们一起使用时，可以在很多研究与应用领域提高数据收集与分析的效率，如实验室、温室、植物育种筛选项目等。

本文我们将讨论如何使用这两种仪器在更快的时间内收集更大的数据样本，以作更详细地探索植物生理特征。为了能更加直观展现二者结合使用的优势，本文将从光合生理研究入手，辅以技术设计考虑，最后以一个实际应用案例的数据展示其结合应用的优势。该研究案例首先使用LI-600筛选对水分胁迫敏感的野生辣椒品种，再结合使用LI-6800针对筛选出的品质进行深入生理指标研究。LI-600的高通量筛选功能在此得以展现，在一天内使用一台LI-600测量了500多片叶片样本，通过这个大样本量调查数据筛选出目标个体，再使用LI-6800做进一步深入全面的植物生理指标分析评估。

■ 气体交换和光合作用

叶片进行着许多复杂的生理过程，其中如何在叶片内部和大气之间交换二氧化碳(CO₂)和水(H₂O)备受关注。图1是光合碳同化(CO₂)和水汽交换，即蒸腾作用(H₂O)这两个主要过程的示意图，这些气体通常通过气孔进出叶片。气孔能够对外界刺激或胁迫做出响应，表现为打开或关闭气孔，以控制交换速率。

随着气体在叶片内外的扩散，叶绿体中的光合机构开始了光合作用。这个过程包括发生在基质中的暗反应/卡尔文循环和发生在类囊体膜上的光反应。

图1 叶片（上图）和细胞（下图）剖面展示LI-600和LI-6800测量的生化过程

■ LI-600荧光-气孔测量仪

气孔计的主要目的是定量化分析叶片和环境之间的水汽交换。这种交换可以被植物根部从土壤中吸收水分的能力所限制，也可以被叶片气孔所调节。基于这些考虑，LI-600的设计旨在环境条件下准确而迅速地量化这种交换。 

LI-600的开路式设计确保实时测量的结果准确反映了叶片在当前环境下的状态。只要在测量时不要遮荫叶片且不改变其角度，就不存在叶片与叶室条件的平衡，就可以快速测量大量的叶片。内置的条形码扫描器能够自动捕获数据标签，无需手动输入，进一步支持高通量调查取样。

LI-600体积小、重量轻，可以在现场单手操作，并且可以很容易地夹取叶片（图2）。

图2 LI-600设计为单手操作

两个相对湿度传感器分别测量空气与叶片相互作用前、后的湿度值。叶片温度是用非接触式红外热电偶（IRT）测得。微型泵为系统提供气流。这种开路式设计（流动的空气和准确的流量计）确保LI-600在快速准确获取总导度基础上，进一步计算出边界层导度和气孔导度。

选购LI-600荧光计，LI-600还可实现测量气孔导度的同时，同步测量叶绿素a荧光参数，实现对光系统 II （PSII）进行非侵入性测量，开放式设计允许仪器在环境背景光条件下准确测量，进行PSII光化学相关研究。

■ LI-6800高级光合荧光测量系统

LI-6800提供的是一套完整的量化光合作用的解决方案。它采用两个红外气体分析仪(IRGAs)来量化CO₂和H₂O的通量。叶片(或整株植物)*封闭在一个叶室内，环境(CO₂、H₂O、温度、气流、光强度和光谱)可以由用户控制。

叶室内环境控制确保在整个实验过程中保持恒定，测量结果具有直接可比性。LI-6800还允许用户改变叶室内测量环境，并量化叶片对这些变化的响应，如光照(A-Q曲线)或二氧化碳浓度(A-Ci)。然而，这样的测量通常是耗时的，而且叶室内环境改变越大，叶片需要的适应时间就越长。

图3 LI-6800主机、分析器头部和荧光叶室

LI-6800可配置多种叶室，适用于不同的应用，如测量土壤CO₂通量、整株植物气体交换、藻类、水生植物或果实呼吸/动物呼吸等（图4）。

图4 LI-6800各种叶室设计从左到右，

上排：3×3 cm透明叶室，拟南芥等小植物叶室，6×6 cm红绿蓝白光源及叶室，自制叶室；

下排：6×6 cm透明叶室，苔藓叶室，土壤呼吸室，昆虫等无脊椎动物呼吸室。

■ 系统对比

■ 测量参数对比

我们已经看到了LI-600和LI-6800在操作和测量技术上的一些差异。这里我们介绍每个仪器能测量的数据以及它的用途。LI-600和LI-6800虽然有一些重叠，但各自都有自己的参数集，这意味着每个特定实验目的很大程度影响着仪器的选择。

LI-600PF和LI-6800F均可测得的参数

● 气孔导度（gsw）：通过气孔运输水分的能力。气孔对水分扩散阻力的反比。在生理学上，它提供了气孔开闭程度的相对测量方法，表示为单位时间单位叶面积的水分传输速率(mol H₂O m^-2 s-1)。但是要注意，在LI-600中，gsw测量的是叶片的单面，而在LI-6800中，测量的是叶片的两面之和，除非使用单面测量套件（货号9968-313）。要用LI-600测量总gsw，可以取叶片两面的测量值并相加。gsw可以作为胁迫的敏感性指标，LI-600和LI-6800可以实时输出该值。

● PSII的量子产率（ΦPSII）：在光系统II (PSII)中叶绿素吸收并用于光化学过程的光的比例，即当前光强下的实际量子效率。由于光诱导的非光化学猝灭过程的积累和叶片的光损伤，这个值通常会低于Fv/Fm。PSII的量子产率与碳同化密切相关，在C3植物中，PSII吸收光与Agross (Anet +Rd)的比值理论上至少为每个碳8个光子 。在非受胁迫植物中，偏离这一规律通常可归因于其他能量耗损导致，如光呼吸、氮代谢或硫代谢。ΦPSII是光适应下测量叶绿素荧光得到的无量纲比例参数，LI-600PF或LI-6800F均可实时测得。

● 量子效率（Fv/Fm）：叶绿素在光系统II (PSII)中捕获光能的光化学效率。一个高度保守且被广泛引用的参数，它对胁迫引起的PSII反应中心的影响很敏感。对于健康的植物，Fv/Fm约为0.8，并随着影响能量捕获或转换的胁迫增加而降低。Fv/Fm是暗适应下测量叶绿素荧光得到的无量纲比例参数，LI-600PF或LI-6800F均可实时测得。由于LI-600 荧光计对环境条件开放，因此在白天测量Fv/Fm时必须小心，不要将叶片暴露在光线下。

● 电子传递速率（ETR）：电子在电子传递链中线性移动的速率，表示为速率(μmol electrons m^-2s^-1)，由叶绿素荧光测量得到。在C3植物中，ETR与Agross (Anet +Rd)的比值理论上至少为每个碳4个电子。偏离这个最小值通常是由于替代电子汇的影响，如光呼吸、氮代谢或硫代谢。ETR是通过测量光适应下叶片的叶绿素荧光参数计算得到，LI-600PF或LI-6800F均可实时测得。测量该参数需要用到LI-600或LI-6800的PAR传感器，确保传感器在测量过程中不被遮挡。

● 非光化学淬灭（NPQ）：与叶片在暗适应状态相比，光下植物光系统II (PSII)通过非光化学途径耗散的能量。NPQ可以被认为是叶片光化学过程无法利用的多余光能。在光强不增加的情况下，NPQ的增加代表光化学效率的降低。NPQ是通过植物在暗适应和光适应状态下叶绿素荧光测量参数计算测得。在测得暗适应下荧光Fm后，LI-6800F可以直接输出NPQ的值。LI-600F的NPQ值可以通过后期数据计算得到。

仅由LI-6800测得的参数

● 净同化速率（Anet）：羧化作用的碳同化与光呼吸和其他呼吸过程造成的碳损失之间的净变化值。碳同化用于支持植物的生长和代谢，表示为单位时间单位叶面积的CO₂吸收速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)，可通过LI-6800实时测得。Anet通常是在模拟植物生长环境的测量室中进行测量。

● 光饱和同化速率（Asat）：光强不限制光化学过程时的净同化速率；饱和光强下的净同化速率。实现Asat的光强代表叶片的可用光强。表示为单位时间单位叶面积CO₂吸收速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)，该值可以来自饱和光强下的Asat点测量，也可以来自光响应(A-Q)曲线。

● 同化速率（Amax）：光和CO₂都不限制光化学过程时的净同化速率，饱和光强及饱和CO₂浓度下的净同化速率。Amax代表叶片的碳同化能力。表示为单位时间单位叶面积的CO₂吸收速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)，该值可以来自饱和条件下的Anet点测量，也可以来自CO₂响应(A-Ci )曲线。

● 呼吸速率（RX）：由线粒体呼吸作用从叶片中流失碳的速率。单位时间单位叶面积CO₂释放速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)。在C3植物中，有几种估算线粒体呼吸的方法：光下呼吸速率，Rd，可以通过光响应曲线内嵌套CO₂响应（A-Ci嵌套在A-Q中）测量来估计。暗呼吸速率，Rn，可以由黑暗中的Anet测量值或光响应(A-Q)曲线的y轴截距来获取。

● 光呼吸速率（RPR）：Rubisco加氧酶活性的结果。此时，Rubisco是加氧而不是羧化。光呼吸作用是一个与光合作用碳同化竞争的过程，并最终导致先前固定的碳的释放。表示为单位时间单位叶面积CO₂的释放速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)。目前有多种方法来估算RPR，包括CO₂响应(A-Ci)曲线与叶绿素荧光耦合以及在低O₂浓度下测同化作用。

● CO₂总导度（gtc）：CO₂通过气孔和边界层的运输能力。CO₂通过气孔进入叶片所受到的扩散阻力的反比。在生理学上，提供了一种随着边界层阻力的影响气孔开闭程度的相对测量方法。表示为单位时间单位叶面积的CO₂运输速率(μmol CO₂ m^-2 s^-1)。气孔导度（gsw）是被更广泛引用的导度参数。

● 水分利用效率（WUEg ）：净同化速率（Anet）与气孔导度（gsw）之比; 描述碳同化过程中潜在的水分消耗。与稳定碳同位素方法测定水分利用效率遵循的物理过程一样，气体交换测量能够在更短的时间内测得水分利用效率。水分蒸发量与瞬时水分利用效率（WUEi）有关。WUEi可以用Anet和gsw计算得到，LI-6800默认输出参数中不包含WUEi。

● 气孔限制值（l ）：气孔的扩散阻力对光合作用的固有限制。环境条件下测的同化速率与当叶片内部CO₂浓度与环境CO₂浓度一致时测得的同化速率的比例。通常由CO₂响应（A-Ci）曲线而来。

● 羧化速率（Vcmax）：用于描述同化作用对CO₂浓度的响应（A-Ci曲线），三个限速过程中的个过程。Vcmax表示Rubisco的固碳速度。它是通过拟合一个函数到A-Ci曲线的初始部分，其中CO₂的可利用性限制了羧化速率。

● 电子传递速率（Jmax）：用于描述同化作用对CO₂浓度的响应（A-Ci曲线）的第二个限速过程。Jmax表示通过电子传递链的电子传递速率(μmol electrons m^-2s^-1)。它来源于拟合的A-Ci曲线中光反应产生的ATP和NADPH限制羧化速率的那一部分。

● 磷酸丙糖利用率（VTPU）：用于描述同化作用对CO₂浓度的响应（A-Ci曲线）的个限速过程。磷酸丙糖利用率是对光合碳同化产物（磷酸丙糖）的输出率，它们在蔗糖合成中的应用以及磷酸盐返回叶绿体的评估。表示为速率（μmol triose phosphate m^-2s^-1），是拟合A-Ci曲线在Amax部分得到的参数。  

■ 案例研究：野生辣椒的水分利用

本研究收集了大量野生辣椒品种，种植后对其农业性状进行筛选，其中，重点关注水分利用和对干旱胁迫的敏感性。

图5 在温室环境中随机选择不同的辣椒品种。从图中也可看出表型范围广泛，一些表现出具有大而直立的叶片，而另一些则表现出狭窄的叶片和萎蔫的外观。

在试验中，将30份原材料分成3份，与一个商业对照品种(18个对照重复)一起种植。植物种植在2 L的花盆中，并在温室条件下生长。在研究开始之前，所有植物保持水分充足。接下来，暂停灌溉，植物开始受到水分胁迫。根据历史数据，预先选择干旱敏感品种和干旱不敏感品种的代表性样本进行详细的表征分析。

 在研究开始之时，水分胁迫之前，首先在五个不同时间点评估了整个种群107 株个体植物的气孔导度 (gsw)。使用LI-600进行测量，测量过程中注意确保叶片角度和叶片表面的光强不受测量影响。LI-600在短时间内快速完成了大量植物样本的测量，在计划时间表内完成每个时间点的高样本通量数据。

图6 使用LI-600测定水分充足(左)和水分胁迫(右)植物的气孔导度(gsw)。所有品种指的是整个种群(n=107)，从中选出干旱敏感(n=3)和干旱不敏感(n=3)品种。

气孔导度与预期的日变化规律一致，在清晨表现出低导度，随着时间和光强的增加，气孔开始打开。气孔导度在中午之前达到峰值，随着温度的升高，下午开始下降(图6)。在充足水分条件下，干旱敏感品种和普通品种之间的气孔导度没有差异。但是，可以观察到对水分胁迫不敏感品种下午时的gsw下降幅度略小。

停止灌溉2天后，土壤明显变干，再次分五个时间点测量整个种群的气孔导度(图6)。此时，干旱敏感品种气孔导度值在所有时间点都显著下降。相比之下，对干旱不敏感品种的气孔导度值在所有时间点能够仍然保持在整个种群平均值附近。

 利用LI-6800光合作用系统对敏感品种和不敏感品种进行了额外的多参数测量表征。在本研究中，使用LI-6800测量了光响应曲线，研究了在0-1800 μmol m^-2 s^-1范围内10种不同光强梯度下CO₂同化速率、气孔导度和叶绿素荧光参数。光响应曲线测量过程中保持叶室内CO₂浓度为400 ppm， VPD为1.5 kPa，叶片温度为30 ℃（图7所示）。

图7 用LI-6800测量的光响应曲线(n=3)   

A-Ci曲线采用动态同化技术（DAT）测定。开始之前，叶片在1500 μmol m^-2 s^-1光强（90%红色，10%蓝色）、30 ℃的叶温、1.5 kPa VPD和1800 ppm 的参比室CO₂浓度下适应。A-Ci响应曲线表明，干旱敏感植物的净同化速率仍然较高，同化速率在40 μmol m^-2 s^-1左右。而干旱不敏感植物的净同化要低得多，值在25 μmol m^-2 s^-1左右（图8）。

从这些曲线获取的参数看，相比不敏感品种气孔限制值增加0.122，干旱敏感品种的气孔限制值增加-0.250。

当查看气孔导度 (gsw) 与净同化速率A（图 9上）关系时，我们观察到两个参数之间存在很强的线性相关性。受到水分胁迫前，干旱敏感品种和不敏感品种之间无明显种间差异，斜率分别为77.7和78.3。干旱处理后，两个种群开始分化。两种品种的固有水分利用效率均有所提高；但相比敏感品种（斜率为102.4），不敏感品种的斜率更大，为112.5。

     图8 LI-6800采集的A/Ci曲线(n=3)                

图9 水分胁迫前（上）、胁迫后（下）的A vs.gsw

结论

● LI-600在5个不同的时间点每个点收集107个测量值，一天之内就能获取535个观测值。通过结合使用这两种仪器，我们可以做出比单独使用任何一种仪器更完整的性状图。

● 从图9可以看出同化速率与气孔导度之间存在较强的相关关系。一旦建立了这样的关系，我们就可以使用LI-600快速收集大量气孔导度的数据，并推断大量植物中叶片的可能同化速率情况。

■ 在线研讨会通知

LI-600能在不控制环境条件下，5-15s内准确测量叶片的气孔导度和叶绿素荧光参数。

LI-6800能在可控环境条件下，测量叶片净光合速率、CO₂和光响应曲线、高频叶绿素荧光及其他光合生理参数。

两者联用，将会显著提高测量效率。

LI-COR公司高级应用科学家Jason Hupp，将和大家分享两者的联用优势和相关应用案例。

时间：2021年9月29日 上午10:00-11:00 （场）

对应北京时间9月29日（星期三）晚11:00-12:00

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主讲人：Jason Hupp

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