多聚精氨酸—胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的制备

西安齐岳生物科技有限公司是国内的抗体偶联科研（ADCs）、纳米颗粒、PEG衍生物；支化聚合物生产制造商;提供的产品有

外源蛋白单链抗体ML3.9(scFv-ML)
人源化IL-2素
素T-CUS
Anti-HER-2-SEC2融合素
人源化抗P185~(HER-2)单区抗体
Anti-HER2 Fab'修饰包裹素蛋白PE38KDEL的靶向纳米粒
靶向HER2和包裹PE38KDEL的PLGA纳米球
蜂素与基因变构人白细胞介素-2融合基因
针对HER2靶点的抗体科研
2E8-NCTD素
靶向EGFR隐蔽表位的素
表皮生长因子受体EGFR和HER2配体寡肽
Anti-HER3抗体
多聚精氨酸—胞嘧啶脱氨酶融合蛋白
靶向nAChR激动剂和基于骨架迁跃的EGFR/HER-2剂
L型氨基酸转运子1(LAT1)和磷酸化s6(phospho-s6,p-s6)核糖体蛋白
多聚精氨酸—胞嘧啶脱氨酶融合蛋白抗活性
抗SSA/Ro 60kDa抗原表位性单克隆抗体
重组人源抗--CTGF scFv二聚体
抗人CD19分子的嵌合抗原受体
融合基因anti-erbB2 scFv-Fc-CD28-CD3(ζ)
二硫键稳定的抗CD3/抗CD 19 (ds-Diabody)微型双功能抗体
鼠抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单链抗体
抗CD20单链抗体
anti-PD-1(scFv)/IL-15/IL-15Rα-sushi(简称PD-S15)
多肽修饰载紫杉醇PLGA微球
BMP2活性多肽/PLGA复合物
多肽RADA16-P24-PLGA共聚物
穿膜肽修饰的PLGA纳米粒
透膜肽修饰的载流感泰得PLGA纳米粒
鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜
穿透肽修饰的载姜黄素PLGA纳米粒
RGD多肽化学修饰聚苯乙烯培养板
RGD多肽表面修饰HA-TCP生物陶瓷
PGA-RGD靶向性的基因载体遮蔽材料
RGD-PGAPMA聚合物
RGD多肽修饰SLA钛片
RGD多肽修饰芬维A铵脂质体
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽修饰多孔钽材料
RGD多肽修饰的无机小牛骨粉
RGD多肽修饰氨基化聚乙二醇活性氧
RGD多肽介导阿霉素-树枝状聚合物
RGD多肽掺杂聚吡咯-铟锡氧化物（RGD-ITO）
RGD序列肽修饰丝素蛋白仿生支架材料
RGD多肽偶联的酞菁硅光敏剂

多聚精氨酸—胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的制备

等生物大分子在许多的发生和中发挥着重要作用，但是根据类药五规则[1]，通常认为类科研具有很差的渗透性。使得这类有价值但无细胞膜穿透性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大。长久以来研究人员致力于探索将这些效应分子导入活细胞的方法。常用的方法有：物理方法，如电穿孔[2]、显微[3]等；生物及化学方法，如洋地黄皂苷处理法[4]、成孔法[5]等；其他方法，如运用素等载体[6]、颗粒(如脂质体)包裹法[7]和载体[8]等。尽管这些方法各有特点，但都存在分子导入率低、易造成细胞损伤甚死亡、操作复杂和难于调控等问题。 细胞穿膜肽（cell pnentrating peptides，CPPs）又称蛋白转导域(protein transductingdomain)、特洛伊肽(Trojan peptides)。通常含有5-30个氨基酸，与其他多肽不同的是，细胞穿膜肽可以通过无细胞性、受体介导自由地导入哺乳动物细胞内部，且不会造成细胞损伤。细胞穿膜肽的发现为生物大分子用于带来了曙光，在细胞生物学、科研体内转运、临床药效评价及细胞学等研究领域均具有的应用前景。目前*以细胞穿膜肽多聚精氨酸为简单。 胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase，CD）是基因中的。胞嘧啶脱氨酶可转化无细胞性的前导科研5氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）为化疗科研5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。5氟尿嘧啶可通过胸苷酸合成酶的活性DNA的复制继而引起细胞凋亡。 所用胞嘧啶脱氨酶，为来源于大肠杆菌的原核胞嘧啶脱氨酶及其突变体。此突变体在的原核胞嘧啶脱氨酶的316位苯丙氨酸和317为天冬氨酸突变为半和甘氨酸。突变后的原核胞嘧啶脱氨酶可对5氟胞嘧啶的转化效率，表现出更强的抑作用。 本实验在原pSUMO载体的基础上构建pSUMO-R9-EGFP，将构建好的载体转化大肠杆菌Rosett（aDE3），经IPTG诱导后通过SDS-PAGE比较SUMO-EGFP及SUMO-R9-EGFP表达量及可溶性的差异。用Ni-NTA亲和层析柱纯化SUMO-R9-EGFP，并利用SUMOprotease I切去SUMO标签，终获得纯度较高的R9-EGFP成熟蛋白。以HepG2细胞为靶细胞，以EGFP为对照，利用流式细胞仪及激光共聚焦检测R9-EGFP的穿膜，结果显示获得的成熟R9-EGFP可进入细胞内部，并聚集于细胞核内，而EGFP无此功能。同时R9-EGFP的穿膜效率呈时间、剂量依赖性，可被肝素。 在pSUMO-R9-EGFP质粒EGFP的位置插入原核胞嘧啶脱氨酶及其突变体，成功表达并纯化多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体等融合蛋白。以HepG2细胞及U251细胞为靶细胞，以单原核胞嘧啶脱氨酶为对照，利用MTT比色法检测两种融合蛋白的细胞活性。结果显示两种融合蛋白均具有细胞性，且突变体优于的原核胞嘧啶脱氨酶，单原核胞嘧啶脱氨酶无细胞性，差异极。 以小鼠肝细胞H22为动物模型，皮下多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体等融合蛋白，腹部5氟胞嘧啶进行。结果显示两种融合蛋白均具有抗活性，与未组和单胞嘧啶脱氨酶组相比，融合蛋白组可延长小鼠存活时间8-10天。经病理切片观测，经多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶及多聚精氨酸-原核胞嘧啶脱氨酶突变体后的较对照组坏死严重。

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