知识详解：细胞培养常见问题及解答

　　1. 如何选用特殊细胞系培养基?

　　培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

　　2. 何时须更换培养基?

　　视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

　　3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基?

　　不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

　　4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类?

　　不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

　　5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

　　6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2?或根本没有影响?

　　一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5% CO2 培养细胞。

　　HBS和EBS 的主要差别在于ts氢钠的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。ts氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

　　8. 什么是细胞的接种密度?

　　依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

　　9. 悬浮性细胞应如何继代处理?

　　一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞的培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

　　10. 冷冻管应如何解冻?

　　取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

　　11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO?

　　除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞)，在解冻之后，应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

　　12. 附着性细胞继代时所使用的trypsin-EDTA 浓度?应如何处理?

　　一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。

　　13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速?

　　回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

　　14. 细胞冷冻培养基的成份为何?

　　动物细胞冷冻保存时*常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

　　15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何?

　　冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4℃，避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。

　　16. 冷冻保存细胞的方法?

　　冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

　　冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?

　　冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

　　18.培养基中是否须添加抗生素?

　　除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

　　19. 应如何避免细胞污染?

　　细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的**方法。当然，适当添加抗生素也是防止细胞污染的途径，Invivogen公司就能提供多种细胞抗生素类产品：

　　Primocin™——原代细胞抗生素

　　Primocin™是专门设计用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。Primocin™对原代细胞没有毒性，因为其作用的靶标只存在于微生物上。其中细菌的靶标为DNA解旋酶和原核细胞核糖体亚基30S和50S;真菌的靶标为麦角固醇(一种只发现于真菌和酵母细胞膜的分子)。

　　产品名称

　　规格

　　产品编号

　　Primocin™

　　500 mg (10 x 1 ml)

　　ant-pm-1

　　1 g (1 x 20 ml)

　　ant-pm-2

　　Normocin™——细菌、真菌、支原体多效抗生素

　　Normocin™具有抗细菌、真菌、支原体三种微生物的作用，其包含两种成分可通过阻断DNA复制和蛋白合成来杀灭细菌和支原体。第三种成分通过干扰细胞膜离子交换来清除酵母和真菌。Normocin™推荐使用浓度为100 mg/ml，该浓度对细胞没有毒性。

　　产品名称　　规格　　产品编号

　　Normocin™

　　500 mg (10 x 1 ml)

　　ant-nr-1

　　1 g (1 x 20 ml) ant-nr-2

　　Fungin™——真菌特异性抗生素

　　Fungin™是Pimaricin(匹马菌素)的可溶性形式，Pimaricin是十九世纪五十年代发现的多烯抗真菌试剂，可通过干扰细胞膜离子交换的方式杀灭酵母、霉菌和真菌。Fungin™十分稳定，在37°C放置6天仍具有活性。与Amphotericin B(lx)需要溶于有毒的脱氧胆酸盐不同，Fungin™是水溶性的，对细胞无毒性，并且不会影响细胞代谢，推荐使用浓度为10 mg/ml - 50 mg/ml。

　　产品名称　　规格　　产品编号

　　Fungin™

　　75 mg (5 x 1.5 ml)

　　ant-fn-1

　　200 mg (1 x 20 ml) ant-fn-2

　　20. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理?

　　原则上：直接灭菌后丢弃之。

　　当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

　　高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

　　(1) 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

　　(2) 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。

　　(3) 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

　　(4) 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

　　(5) 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

　　(6) 重复步骤4。

　　(7) 在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

　　21. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状?

　　不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

　　22. 支原体污染会对细胞培养有何影响?

　　支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。

　　23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理?

　　直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株，但是如果您的样本珍贵，建议您使用支原体去除试剂去除污染

　　Plasmocin™——支原体预防与去除利器

　　Plasmocin™是目前全球*受科研工作者欢迎的支原体抗生素之一。其包含大环内酯物及对苯二酚两种主要成分，可有效作用于支原体复制的蛋白合成阶段和DNA复制阶段，只需两周即可清除支原体污染，并且不会影响细胞本身代谢;其ty的转运载体可以将有效成分转运到细胞内，故对胞内支原体和胞外游离的支原体都十分有效。此外，低浓度的Plasmocin™对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌也有一定的清除作用。

　　Plasmocin™ Treatment (ant-mpt)

　　用于清除支原体污染，使用浓度为25 ug/ml,2周即可清除支原体。

　　Plasmocin™ Prophylactic (ant-mpp)

　　用于预防支原体污染，定期添加于细胞培养基中，使用浓度为2.5 - 5 ug/ml。

　　产品名称　　规格　　产品编号

　　Plasmocin™ treatment

　　50 mg (2 x 1 ml)

　　ant-mpt

　　Plasmocin™ prophylactic

　　25 mg (10 x 1 ml)

　　ant-mpp

　　Plasmocure™——强力清除具有Plasmocin™抗性的支原体

　　据报道在极少数情况下，有些支原体对Plasmocin™ 具有抗性。基于此，InvivoGen又开发了第二款支原体抗生素Plasmocure™。Plasmocure™采用不同于Plasmocin™作用机制的两种抗生素来杀灭支原体，处理两周时间即可清除这些顽固支原体。在处理过程中有轻度的细胞毒性，但支原体清除后细胞系可恢复。Plasmocure™推荐使用浓度为50 mg/ml。

　　产品名称　　规格　　产品编号

　　Plasmocure™

　　100 mg (1 x 1 ml)

　　ant-pc

　　24. CO2 培养箱的水盘如何保持清洁?

　　定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

　　25. 为何培养基保存于4℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性?

　　培养基保存于4℃冰箱中，培养基内的CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2， 以调整pH 值。

　　26. 各种细胞培养用的dish，flask是否均相同?

　　不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同的dish 或flask 而有显著的生长差异。

　　27. 购买的细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少的情形?

　　研究人员在冷冻细胞的培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。

　　28. 购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因?

　　研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80℃太久。

　　29. 如何避免沉淀物的产生?

　　我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作:

　　(1) 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，非常容易产生沉淀物。

　　(2) 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

　　(3) 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

　　(4) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

　　(5) 若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

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