细胞冻存的实验步骤和实验原理

　　细胞冻存实验原理:

　　在不附加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，能导致细胞发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变、蛋白质变性等等，终导致细胞死亡。但如向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避免上述现象的发生。冻存在﹣135 ℃以下低温中，能减少冰晶的形成。而融化细胞时速度则要快，使之迅速通过易受损的-5~0 ℃以后，细胞活力不受损害，仍能生长增殖。当前常用的保护剂仍为甘油和DMSO，它们对细胞无毒、分子量小、溶解度大、易穿透细胞，使用范围在5%~15 %之间，常用10 %。

　　实验步骤:

　　1.细胞

　　选项对数生长期细胞;收集细胞24 小时前换液一次。

　　2、制备细胞悬液：

　　用75%酒精棉球消毒超净工作台台面，然后用75%酒精棉球消毒双手及暴露部位。用75%酒精棉球消毒各培养用液的瓶盖以及培养瓶瓶盖部位，并在酒精灯外焰上方一过，拧开瓶盖，将瓶口再在酒精灯外焰上方一过后，拧上瓶盖，但不要拧紧，以便下步操作。轻轻将细胞培养瓶内旧培养液倒入烧杯中，注意不要让瓶口碰到烧杯，不要让液体溅出。

　　吸取PE液3ml加入瓶内，加入时注意从侧面加入而不能直接冲细胞贴壁处，避免造成细胞脱壁，然后盖上盖子，平放轻摇40下，轻轻倒出，要求倒干净。加入0.3ml的0.25%ygbm液，加入时直冲细胞贴壁处，平放轻摇，使酶液漫过整个瓶底部，一分钟之内将培养瓶放在倒置显微镜台上进行观察，可发现细胞质渐渐回缩，细胞间隙增大，细胞慢慢变圆，用手掌拍打瓶底和瓶侧，使细胞从瓶壁上脱落下来并分散，呈悬浮状。立即加入5mlMEM+10%小牛血清，用吸管向瓶壁轻轻吹吸几次，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞全部从瓶壁脱落并形成均匀的细胞悬液。

　　3、按常规法把细胞制成细胞悬液，计数、令细胞密度达5×106 /ml (如一瓶细胞数量不足则用两瓶或更多的细胞)，离心去上清， 吸入离心管中;先用培养液9 分+DMSO 1 分(或甘油)配成10%的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬;分装入无菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升细胞悬液。

　　4、封口

　　用塑料安瓿时拧紧瓶口即可。必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安瓿缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人。纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。

　　5、冻存

　　当前已有专用细胞冻存器，在无冻存器的情况下，可用手工办法。从把冻存物悬在液氮罐口开始算起，按-1 ℃分钟速度，在30-40 分钟内，下降到液氮面，再停30 分钟后，直投入液氮中。

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