Trizol法提取总RNA的流程及原理

　　提取原理：Trizol试剂的主要成分是bf。bf的主要作用是对细胞进行裂解，从而使细胞当中的蛋白质以及核酸物质解聚而得以释放。bf虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能抑制RNA酶的活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(即RNA酶)。

　　Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品的裂解液或匀浆中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿(CHCl3)后离心，样品能分成水样层和有机层。而RNA存在于水样层中。在收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀的方法来还原。在除去水样层之后，样品中的核酸和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。

　　Trizol试剂不但可用于小量样品(组织：50-100mg;细胞：5×106)，也可用于大量样品(组织≥1g或细胞≥107)，对动物、植物、细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。反应迅速，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保护分析等。

　　本试剂带有颜色，以便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。保存条件：2-8℃，避光保存12个月。

　　实验前需要准备的试剂：

　　Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇(用RNase-Free水配制)，RNase-Free水。

　　实验前需要准备的物品：

　　1ml注射器，1.5ml EP管(DEPC处理过)，大、中、小号枪头(DEPC处理)

　　样品前处理注意点：

　　1.选择新鲜血液。

　　2.选择生长旺盛的组织。

　　3.选择新鲜的幼嫩组织。

　　4.选择处于生长旺盛的时期的细胞。

　　RNA纯化要求：

　　1.纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的物质。

　　2.排除有机溶剂和金属离子的污染。

　　3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到程度。

　　4.排除DNA分子的污染。

　　RNA提取的注意事项：

　　1.杜绝外源酶的污染。

　　(1)严格戴好口罩，手套。

　　(2)实验涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要处理。

　　(3)实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。

　　2.阻止内源酶的活性。

　　(1)选择合适的匀浆方法。

　　(2)选择合适的裂解液。

　　(3)控制好样品的起始量。

　　3.明确自己的提取目的。

　　(1)任何裂解液体系在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。

　　(2)RNA提取成功的经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

　　Rnase污染的来源

　　手指头，枪头，水/缓冲液，实验台面，内源Rnase，RNA样品，质粒提取，RNA保存，阳离子(Ca，Mg)，后续实验所用的酶。

　　操作流程：

　　1.样品的处理：

　　(1)培养细胞：收获细胞1-5×107，加入1ml Trizol(异硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol)，混匀;用1ml注射器反复抽取(约30次)以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min(使核酸蛋白复合物分离)。

　　(2)组织：取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

　　2.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质(肌肉，植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

　　3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15-30s，静置2-3min。

　　4.4℃离心，12000g×15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅，即大约600 ul。

　　5.小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相)，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

　　6.4℃离心，12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

　　7.弃上清，于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml，振摇，充分洗涤沉淀。

　　8.4℃离心，12000g×5min。

　　9.弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。

　　10.加入适量(20μl)DEPC (RnaseFree)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。

　　11.取2μl进行电泳，其余-80℃保存。

　　温馨提示：

　　1.关于液氮研磨：

　　万事开头难，液氮研磨是最开始的步骤，也是最辛苦的步骤。很多女孩子都怕液氮，毕竟是零下近200度的东西，当然不是闹着玩的。不过只要小心操作，一般没啥问题，呵呵。找一个保温杯，倒出一些液氮，然后再往研钵里倒。研磨的时候多加几次液氮，组织会慢慢变脆，就会好研一些，对于一些含水量比较大，很硬的组织，准备刀片，切成小块后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉状，但至少得看不到明显的颗粒，这样Trizol才能充分和组织接触，快速裂解组织，也能防止组织的降解(Trizol内含RNA酶抑制剂)。

　　2.关于组织量：

　　研磨前最后称一下组织的重量，毕竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的组织。Trizol里面是含有RNA酶抑制剂的，如果组织过量，Trizol无法浸润组织无法裂解组织，多余组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。

　　3.关于提取步骤：

　　标准Trizol提取步骤为液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--离心--加入异丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心。

　　因为提取的组织，在加入Trizol后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后，可以将裂解液放到-80冻存半小时以上，据说冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和RNA。

　　4.关于各步骤的时间：

　　标准的时间是

　　a.液氮研磨(没时间要求，只要组织不化就好,一般一个组织十分钟左右，女孩子可能时间长一些，毕竟体力活)

　　b.加入Trizol裂解5-10分钟(我觉得还是10分钟比较好，有人说这步要放在冰上，但是我的经验室温就可以，室温更有利于Trizol发挥作用，而且毕竟Trizol含有RNA酶抑制剂，不用担心RNA降解)

　　c.加入氯仿室温静置15分钟

　　d.离心15分钟，这是关键的一步，离心后分成三层，RNA在上清里，所以离心管从离心机拿出来的时候要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定一定轻，切忌吸取太多，少量即可，吸到400-500ul就OK了，再多就容易碰到下层沉淀了。

　　e.加入异丙醇静置10min，然后离心10min。

　　f.用75%酒精洗涤沉淀，帮助分离剩余的有机试剂(剩余有机试剂过多会影响OD值和PCR反应)，所以酒精尽量多加一些，一般说明书没有说明这一步的时间，只是说剧烈涡旋震荡，我的经验是一定把沉淀弹起来，让浮在酒精中，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。

　　g.加入DEPC处理水，组织提取出来的量还是挺大的，虽然不是很纯，所以溶解液还是不能太少，至少要50ul，之前一个大姐给我说加20ul就可以，结果浓度直接高的光度计测不出来了。而且浓度太高跑电泳时也跑不开，没法鉴定。

　　5.关于RNA电泳鉴定：

　　RNA很脆弱，跑电泳的时候也容易降解，但是也没必要就非得用崭新配置的TBE电泳液，电泳液不要太脏就可以。电泳点样量不要太大，毕竟组织提取的RNA纯度不会很高，多少还有一些杂质，太多的话不仅容易使RNA降解，还有影响电泳效率，跑不开。

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