古朵带认识HE染色的基本原理

　　古朵生物介绍一种细胞实验常用的染色方法，即苏木精—伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法。

　　一、HE染色基本原理

　　(1)细胞核染色原理

　　苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

　　(2)细胞浆染色原理

　　细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷(阳离子)，就可被带负电荷(阴离子)的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷(阳离子)结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

　　(3)细胞HE染色流程

　　培养的细胞HE染色过程与组织切片的染色过程基本相同，包括样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明、封固和观察等步骤。

　　1.样品制备

　　细胞：取细胞密度约为1×105/mL接种于含盖玻片的培养瓶中，放入CO2培养箱中培养一段时间，待细胞基本长成单层，取出长有细胞的盖玻片，用PBS洗3次。

　　2.染细胞核

　　①.固定

　　1)将盖玻片浸入95%乙醇固定15min，PBS洗2次，每次1min;

　　2)浸入苏木精染液，染色5-10min。

　　②.分色

　　1)自来水浸洗，浸入稀xys乙醇溶液进行分色，数秒即可;

　　2)自来水浸洗，浸入淡氨水中，使胞核蓝化3-5min;

　　3)自来水浸洗。

　　③.染细胞质

　　1)浸入伊红染液，染色5-10min;

　　2)自来水浸洗;

　　3.脱水

　　逐级脱水：经70%、80%、90%乙醇各脱水1次，95%乙醇脱水2次，bai分百的乙醇脱水3次，每次1min。

　　4.透明

　　二甲苯透明3次，每次1min。

　　5.封固

　　在载玻片上滴加中性树胶，将有细胞一面的盖玻片向下封固于载玻片上。

　　6.观察

　　光镜下观察，细胞质呈粉红色，细胞核呈蓝紫色。

　　注意事项：

　　①.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和tan酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

　　②.切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

　　③.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不che底，应将切片退回wu水酒精，换酒精、二甲苯，以求che底脱水与透明。

　　④.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

　　⑤.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

　　⑥.zui后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

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