Fab单链二抗在免疫组化/免疫荧光/mIHC 封闭实验中的应用

　　免疫学实验中，经常会出现高背景值，影响实验结果的检测。这是因为在使用相关免疫学试剂时，蛋白与未吸附的固体载相结合，发生非特异性结合造成的。免疫学实验中常通过封闭试剂来封闭这样的固相载体部位，以减少或消除非特异性结合背景的影响。

　　常见的封闭剂包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白BSA、动物血清和Fab片段单链二抗。因为奶粉中可能存在天然的生物s、碱性磷酸酶，不适合用于磷酸化蛋白检测的封闭以及使用生物s和碱性磷酸酶系统的检测实验。另外，脱脂奶粉中可能含有牛IgG，能够与抗牛、山羊、绵羊、马等二抗有较强的交叉反应，会造成一定的背景。相较于其他封闭剂，脱脂牛奶作为封闭剂的应用范围较窄。(茹创生物为您提供全面的免疫学封闭解决方案)

　　免疫学试验中常通过封闭试剂来封闭未吸附蛋白的固相载体部位，以减少非特异性结合背景的影响。比如ELISA 试验中继包被之后用0.05-0.5% BSA 等溶液来占据未能被包被的空隙;又如WB 试验中常用5% 脱脂奶粉或者BSA 封闭膜上除转印蛋白占据的其它部位。除了用于封闭未吸附蛋白的固相载体，封闭试剂也被广泛用于封闭其它非特异性结合。如ELISA 实验中，特异性抗体与血清样本中IgM、IgG 型类风湿因子以及补体等组分产生非特异性结合;IHC、IF 等试验中，特异性抗体与样本中Fc 受体的结合，以及在IHC 和IF 双染或三染实验中，驴血清也被广泛用于封闭试剂以减少抗体之间的非特异性结合;另外，Fab 片段单链二抗也被用于荧光、组化/mIHC中的有效封闭。

　　牛血清白蛋白BSA

　　BSA是最为常见的封闭试剂，与脱脂奶粉相比，BSA组分相对单一，适用于ELISA实验，生物s、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或者其他对特异性要求较高的实验。值得注意的是，普通级别的BSA中也可能存在牛IgG，因此与能够与抗牛、山羊、绵羊、马等二抗有较强的交叉反应，会造成一定的背景，建议使用不含IgG的BSA产品。

　　动物血清serum

　　封闭用血清来源选择应与二抗为相同种属来源作为封闭剂。

　　封闭血清的主要原理：

　　1.待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高。这点与BSA原理相同。

　　2.待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，而因为封闭血清中含有抗体，因此用血清可以封闭一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。这是BSA无法满足的。需要注意的是，某些封闭血清内可能会含有d氮化钠，因此不适用于HRP酶标的免疫学检测体系。

　　Fab片段单链二抗

　　由于二价的抗体(全IgG或F(ab’)2片段)有两个结合位点，不能用来封闭。而Fab片段单链二抗只有一个结合位点，因此可封闭免疫球蛋白。例如，在两个单抗的双标实验中，可用于封闭样本表面的免疫球蛋白，也可用于封闭组织切片或细胞表面的内源性免疫球蛋白。Fab片段二抗非常适合封闭IgG、IgM等免疫球蛋白。一般用于血清封闭后使用10-20ug/ml浓度的Fab抗体，可有效封闭内源性IgG蛋白。比如免疫组化 ：小鼠标本 肾脏 用mouse来源抗体CD68染色，在进行孵育CD68(mouse来源)一抗之前，加一个步骤：用Fab抗小鼠IgG多克隆片段(针对mouse IgG的多个靶点)封闭，然后PBS洗三次，能明显改善非特异性反应(降低内源性IgG的干扰);最最上面的图A 图B ，具体验证结果如上：mouse的肺脏标本，经 某mouse来源的一抗，荧光单标显示对比结果：Fab片段能极大降低内源性IgG的干扰

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