间接免疫荧光法检测自身抗体

　　自身抗体诊断的标准技术是间接免疫荧光法，其特点是特异性强，阳性与阴性样品的信号强度对比明显，通过显微镜观测能够精确地判断组织或细胞内荧光的分布。自身抗原的位置决定了其相应抗体的典型的荧光模式，所有与此典型模式不相关区域的染色被认为是非特异性染色。即使偶尔伴有强的非特异性染色，但弱的特异性信号也能够被识别。间接免疫荧光法不需要复杂、费时的化学制备程序，而酶联免疫吸附测定等实验，要取得高特异性则必须提取和纯化抗原，并将其吸附于固相载体上，如果抗原不纯，则相关抗体会出现假阳性结果。 间接免疫荧光法保留了原基质的完整抗原谱，因而可同时检测大量抗体.获得较高的检测效率。当抗几种不同抗原的抗体需要在一种生物基质上同时检测时(如抗细胞核抗原抗体)，或为每一种实验逐一准备抗原很困难或相当复杂时，就应该选择免疫荧光法。另外，应用免疫荧光法还可检测到一些至今未知的抗体。

　　在没有荧光显微镜时，可尝试用酶标记的第二抗体代替荧光标记的抗体，但是检测的质量会明显下降。因为在免疫荧光法中，指示剂染色是通过抗体直接结合在细胞抗原上产生的，而免疫酶法，染色则是弥散地围绕在抗原周围的区域。因此免疫酶法并不总是像免疫荧光法那样能区分抗原分布的细小差别。而且应用酶染色时，会导致许多自身抗体不能被区分或根本测不到。仅应用细胞核制备物免疫酶染色的纯光度法评价也是不可取的，因为这不可避免地导致一些自身抗体被漏检。

　　实验室工作者需要经过一定的专业训练并不断实践，方可胜任荧光显微镜下的读片工作。显微镜下的结果判断，为综合知识的体现，到目前为止，尚没有任何仪器可取代人工读片。

　　(一)实验基质的选择和血清的稀释度

　　1.实验基质的选择用间接免疫荧光法对自身抗体进行测定的效果，在很大程度上取决于基质的质量(包括基质本身的质量及制备的质量)。这些实验基质，通常是用动物或人类的细胞或组织，经一系列方法进行处理，如Hep-2细胞的培养、吸附和固定，玲冻组织切片的制备、贴片等。国内不少实验室仍在自制实验基质，这已越来越不适应实验标准化、规范化、现代化的需要，建议应尽可能选择生产工艺先进、质控措施严格的商品化试剂盒，以保证实验结果准确可靠。检测不同的自身抗体应选择不同来源的实验基质(不同动物的不同组织)。

　　2.血清的稀释度　一般来讲，一个待测标本，要测定某种或多种自身抗体，通常需要先测定一个起始稀释度。如该稀释度的检测结果为阴性，则认为该抗体或多种抗体不显著存在(无临床价值)，通常无需稀释标本做进一步检测。如果该稀释度的检测结果为阳性，则认为该抗体明显存在(可能有临床意义)，可将标本做进一步稀释，以获得该抗体的滴度。因此确定待测标本合适的起始稀释度，显得十分重要。由于待测血清的起始稀释度是结合临床统计所得，而不同的实验室采用的方法学有差异，故不同实验室的血清起始稀释度可能不同。另外，为了避免前带现象的发生，有时对可疑的阴性标本，尚需进一步的稀释后进行测定。

　　(二)实验操作的标准化滴定平板技术

　　实验标准化流程为滴加样品、标记抗体至加样板，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。因为液体被局限在一封闭的空间，不再需要传统“湿盒”，可同时在一致的反应条件孵育大量的标本。下面以间接免疫荧光法为例，介绍滴定平板技术的操作过程：

　　1.准备　检查加样板：观察是否反应区亲水而周边疏水，如果不是，用湿纸巾擦干净，随后从试剂盒中取出载片，等平衡至室温时方可打开包装。注意不要触摸生物薄片，用笔编号、标记。

　　2.稀释血清　根据使用者实验设计，用PBS-Tween缓冲液稀释血清，每次实验均需阳性、阴性对照，使用前要混匀。

　　3.加样　按顺序分别滴加25ul稀释后血清至加样板每一反应区，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后再开始温育。

　　4.第一步温育　将载片贴有基质的一面朝下盖在加样板的凹糟里，反应即开始。室温下温育30分钟。

　　5.冲洗　用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗载片1秒钟(注意水流不要太急，不要直接对着基质)，然后立即将其浸入装有PBS-Tween缓冲液的小杯，浸洗至少1分钟。

　　6.加样滴加20ul异硫氰酸荧光素标记的抗人球蛋白至一洁净加样板的反应区，加完方可继续温育。异硫氰酸荧光素标记抗人球蛋白使用前需混匀，用PBS-Tween缓冲液稀释。

　　7.第二步温育从PBSTween缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦干背面和边缘后，立即盖在加样板上，注意不要擦拭反应区。注意避免阳光直接照射载片，室温温育30分钟。

　　8.冲洗用烧杯盛PBS—Tween缓冲液流水冲载片1秒钟(水流不要太急，不要直接对着基质)，然后立即将其浸入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少1分钟。

　　9.封片加甘油/PBS至盖玻片，每一反应区约10ul。从pBS-Tween缓冲液取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间鲸。将盖玻片轻轻盖在载片上。

　　10.结果判断　荧光显微镜下观察荧光。

　　(三)抗体检测的质量控制及注意事项

　　l.质量控制　自身抗体检测的质量控制是用多种手段对自身抗体存在与否、浓度的多少进行控制和评价，有利于实验室内部、实验室之间对同一标本获取相同具有可比性的结果，是衡量实验室检测水平的一个重要指标。然而.自身抗体检测的质量控制，并不是一件容易的工作。因为不同实验室所用的抗原基质存在差异、抗原的固定方法有差异或不同，血清的稀释方法不同以及操作者对不同荧光模式的识别能力不同等，均可影响到自身抗体的检酒质量。实验室在进行临床检测时，应同时检测阳性对照、阴性对照，以监测结果的准确性。国内急需成立专门的学术机构，参照国际标准，与国际接轨，建立自己当地的标准，开展自身抗体检测的质量控制。

　　2.实验结果的进一步确认(两级测定)　间接免疫荧光法，提供了对自身抗体进行筛选的理想途径。许多情况下，仅使用该方法就可为临床提供足够的诊断信息，不需要做进一步的实验。在自身抗体的检测中，称间接免疫荧光法为“水平1测定”。如果有必要对自身抗体进行进一步的单特异性区分，则可应用其他方法，如酶免疫测定法、对流免疫电泳及免疫双扩散法等，称这些实验为“水平2测定。酶免疫测定法所用的抗原必须为纯化的。许多抗原不易被纯化，且很多自身抗体的确切抗原至今未知。故目前只有一小部分用HEp-2细胞柱测到的抗体及小部分组织抗体，进行进一步单特异性检测。然而抗体的最终区分，需要使用纯化的抗原作为实验基质。单独的“水平2”测定，不能适应自身抗体检测的需要。特别是对抗核抗体的测定，单做“水平2”测定将会漏掉某些自身抗体，故必须同时用免疫荧光法进行检测。

　　3.实验报告及解释

　　(1)阴性：在整个检测系统(包括各种质控)正常的情况下，当待检标本在合适的起始稀释度下，实验基质没有明显的荧光染色，或没有可辨认的荧光模型时，称此待检的血清样本的某种自身抗体阴性。

　　(2)阳性：整个检测系统(包括各种质控)正常的情况下，当血清待检标本在合适的起始稀释度下，产生明显高于阴性对照的特异荧光，且有明鲜可以辨认的荧光模式，称此待检血清标本的某待检抗体阳性。

　　注意，有时申请报告中，申请检测的自身抗体结果为阴性，而发现其他自身抗体为阳性。在这种情况下，如果该检测到的自身抗体有明显的临床意义，则要报告此结果。如该自身抗体无明确临床意义，则可不报告，以避免造成混乱。但如果临床医生与实验室工作者进行研究合作，则可报告或另外进行交流。

　　(3)免疫荧光模式;对阳性结果应报告其荧光模式，以初步提供自身抗体针对的靶抗原特异性，为进一步进行“水平2”检测提供信息。

　　(4)滴度：滴度的定义为：与相同稀释倍数的阴性血清比较，能观测到的特异性的荧光反应的最高稀释度。检测结果应该报告滴度，为临床提供动态的信息，因为自身抗体阳性患者，在诊断和治疗过程中，要做多次检测，且有些自身抗体的滴度与病情密切相关。

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