实验：免疫核糖核酸的制备及鉴定实验

　　实验概要

　　本实验通过免疫动物，制备了免疫核糖核酸(iRNA)，并进行了鉴定。

　　实验原理

　　iRNA是用某种抗原免疫动物后，从免疫动物的免疫活性细胞中提取出来的RNA。它具有传递相应抗原特异性免疫信息的能力，因而注入体内后，可发挥对该抗原的免疫清除作用。

　　iRNA的免疫学作用机理目前尚无定论，一般认为iRNA具有直接模板作用，即iRNA以mRNA的形式在受体细胞中起模板作用，从而合成与免疫反应有关的蛋白质，使正常非致敏的淋巴细胞转变成致敏淋巴细胞。另外，也有人认为iRNA具有逆转录作用、免疫调控作用及“超抗原”作用等。

　　实验步骤

　　1. 动物免疫

　　1) 抗原制备：根据欲制备的免疫核糖核酸的目的不同，采用不同的抗原。

　　如欲制备抗乙肝iRNA，可采用乙肝疫苗，每20μg乙肝疫苗，加1ml弗氏不佐剂(液体石蜡8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg，充分混匀并乳化合格后备用。

　　2) 动物选择及免疫：大量制备时，多选用绵羊或山羊，小量制备时，可选用家兔或豚鼠，所用动物应健壮无病。免疫方法为背部及两肘窝多点皮下注射上述乳化疫苗，同时腹腔注射10μg乙肝疫苗，其后每周腹腔注射20μg，共4次。

　　3) 效价测定及脏器采取：第4次免疫后1周，静脉采血，分离血清，用ELISA测效价，如效价在1:800以上即合格。处死动物，采取脾脏及淋巴结，置-20℃保存备用。

　　2. iRNA的提取(热酚法)

　　1) 粗提：将脾脏及淋巴结去掉结缔组织及被膜，用生理盐水洗净，切碎，洗去血液，挤干。每200g组织加200ml盐水，置高速组织捣碎机中制成匀浆(以8000～10 000r/min匀浆两次，每次1～2min)。

　　向上述匀浆中加入b酚溶液(b酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml，混匀，置60℃水浴振荡10min，置冰浴冷却10min，以3500r/min离心30min，取上清液置冰浴中。

　　2) 精制：在上述上清中加入半量b酚溶液，室温下剧烈振荡10min，以3500r/min离心20min，取水相。加2～3倍体积95%酒精，置冰箱(普通或低温冰箱均可)过夜。以3500r/min离心30min，弃上清，取沉淀。取少许沉淀，溶于适量水中，测DNA含量及蛋白质，合格后可做下步。

　　3. 除菌、分装及冻干

　　取上述沉淀，加适量三馏水溶解，取少量用紫外分光光度计测RNA含量，按测定结果，将上述溶液用三馏水稀释至约2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐，混匀。用微孔滤膜滤过除菌，分装(1mg/支)，冻干，封口，待检。

　　4. 检定

　　1) pH值，取本品2支，溶于10ml馏水中，其pH值应为68～80。

　　2) 吸收度，取本品溶于馏水中，用紫外分光光度计检测，其OD260/OD280应不小于20。

　　3) DNA含量测定，用标准DNA作对照，以紫外法测定，DNA含量不大于5%。

　　4) RNA含量测定，取本品3支，分别溶解于50ml馏水中，按《中国药典》二部附录法测定，三支含量均应在095mg以上。

　　5) 异常毒性，取本品，以注射用生理盐水制成05mg/ml溶液，家兔可静脉注射，应无异常反应。

　　6) 无菌检查，取本品3支，溶于6ml无菌水中，分别接种于普通培养基，厌氧培养基及霉菌培养基，培养1周，应无菌生长。

　　7) 活性测定，采用白细胞粘附抑制试验。其原理为正常白细胞在体外培养时，可粘附于玻璃表面，而用iRNA处理过的白细胞，其粘附于玻璃表面的能力则被抑制，测知该粘附抑制率，即知iRNA活性。方法为：取绵羊抗凝血，分离白细胞，将白细胞调节为在血细胞计数板上每大格内含40～80个细胞的浓度。取细胞悬液，加等体积iRNA溶液，37℃水浴后，移入血细胞计数板，置37℃温育后，用盐水冲洗、计数。同时作正常白细胞(不加iRNA)对照。计算白细胞粘附抑制率，如大于20%为合格。

　　注意事项

　　1. 温度对iRNA活性影响较大。提取过程须加热时，应严格控制温度及时间。提取间歇时，应置冰浴中。

　　2. 严格控制RNA酶。RNA酶分布广泛，如污染RNA酶可将iRNA降解而失去活性。因此，各步均应严格控制，如器皿泡洗后，应干热灭菌，操作者应带手套，提取过程中，可加入RNA酶抑制剂等。

　　3. RNA的提取主要有热酚法及冷酚法两种，前者产率高，但易引起RNA的变性和降解;冷酚法(0～4℃)不易引起RNA的变性和降解，但产率较低。

　　4. b酚为冰状固体，如颜色变红，是为氧化之故，应废弃。b酚加热融化后，方可配制，配制时，配制者应注意防护。如b酚配制后须较长时间存放，应加入8羟基喹啉以抗氧化。

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