真菌保藏的基本原理及保藏工艺的要点
时间：2024-08-15 阅读：142
真菌研究及其生物工业的发展，必然和安全、长效的保藏技术方法联系，对于有重要经济价值的菌株来说，其保藏技术处理和保藏过程中生理、基因性状的损害、变异，将会带来巨大损失。真菌种类的多样性异常丰富，据估计存在150万种真菌（Hawksworth, 1991），而还不到5%的真菌被描述，只有很少的种类有合适保藏的工艺技术（Ryan，2000），且保藏效果存在菌株水平上的差异性。本文针对近几年真菌保藏领域采取的新技术、原理及适用的保藏研究对象进行了概述。
1、真菌保藏的基本原理及保藏工艺的要点
微生物保藏的最终目的是保持菌株的纯度、活性、基因信息的完整性、避免菌株变异和降低退化。多种保藏技术方法适用于真菌的保藏，大体可以分为三类(Smith et al, 2001)：
一是让真菌连续生长的保藏技术。这一类的保藏技术的特点是不断的将菌株移植在新鲜的培养基上，并在合适的条件下生长，随后至于一个低温的环境中，一般是4-10℃，这类保藏技术主要包括斜面移植、油管保藏和蒸馏水保藏等方法。
二是利用干燥环境保藏菌株的休眠体，如分生孢子、厚垣孢子等，干燥选用的基质可以是空气、硅胶、土壤、沙子等。
三是利用抑制菌株代谢活性的办法达到长期保藏，一般是通过脱水降低细胞内水分或低温冷冻，在此过程中关键环节是避免和降低冰晶细胞造成的伤害，这类保藏工艺包括冷冻干燥法、低温冻结和液氮保藏法等。
各种保藏方法优劣比较如下：
表1 各保藏技术方法的优、缺点及保藏周期（引自Ryan & Smith, 2004）
| 保藏方法 | 优点 | 缺点 | 保藏周期 |
| 斜面移植法 | 方法直接,花费较少 | 转接周期短,污染风险 菌株易变异 | 14d-1年 |
| 油管保藏法 | 方法直接,花费较少 | 菌株退化,污染风险 菌株易变异 | -10年 |
| 蒸馏水保法 | 方法直接,花费较少 | 菌株退化,污染风险 菌株易变异 | -10年 |
| 沙土管保法 | 方法直接,花费较少 | 湿度大时易恶化 保藏内容物太多 | -10年 |
| 硅胶保藏法 | 方法直接,花费较少 | 硅胶有毒性影响 只能保存产孢子的真菌 | -25年 |
| 冷冻干燥法 | 长时间保藏 容易储藏及发放 | 方法复杂，耗时较长，设备较贵，不适用于不产孢的真菌 | -50年 |
低温冻结法 （超低温冰箱保藏） | 方法直接 降低菌株变异 | 设备较贵，必须有电力不间断供应，一些低温保护剂可能对真菌有毒性 | -40年 |
| 液氮保藏法 | 适用于大多数真菌，针对不同的属可以最大优化处理，降低菌株变异 | 设备昂贵，控制降温速率，必须保证液氮的充足供应，降低菌株变异 | 无限期 |
注：保藏周期指多数情况，特例除外。
真菌的长期保藏要保证菌株的生理性状和遗传信息的完整性（Ryan & Smith, 2003），而保藏过程中仅以活性指标判断真菌的是否保藏完好有些片面。Kuhls & Borner (1995) 研究来自不同菌种保藏中心的同一个Trichoderma sp菌株时，再在PCR-指纹检测结果中出现了偏差（Kuhls & Borner , 1995)。Kelly等(1994）将保藏了12年的Fusarium oxysporium f.sp.ciceris 和这一种的其他菌株比较，发现该菌株没有显现出典型的分子指纹特征，证实该菌株已发生退化。Horgen等 (1996) 证实了Agaricus bisporus 的不同传代菌株出现染色体异常和RFLP指纹的多型性。一些没有经过*化保藏程序的Metarhizium anisopliae 菌株处理，其PCR分子指纹证据显示出了多型性的特征，报道M. anisopliae 菌株经过连续传代培养后，出现“角变”并伴随着一些生理性状的变化（Ryan et al., 2002）。Santors 等（2002） 报道Penicillum expansum 长期保藏后的菌株产棒曲霉素（patulin）和橘霉素（citrinin）的功能受到影响。