小鼠丝裂原激活蛋白激酶13elisa

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小鼠丝裂原激活蛋白激酶13elisa

注意事项：1. ELISA用的所有液体系统，记得一定要预先调PH值到7.2-7.4之间，按照说明书都无菌过滤过。1XPBS的PH值在7.68左右，仍然需要加盐酸调酸一点。Trizma base配出来，PH在9.98,必须调PH!否则ELISA中抗原抗体根本不能正常结合。蛋白对于PH值极度敏感。2. 无菌要求多高，现在不知道。建议无菌配好的液体放在4度冰箱保存。每次用之前，放在室温下至少15分钟。ELISA用的液体，室温的温度，效果比较好。洗包被液的时候，直接把板子翻过来，弃掉液体。在厚厚的吸水纸上，用力拍打板子，力求把孔中的液体*弃干净。用WASH BUFFER洗涤三次。因为孔的容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆盖满。所以，建议洗板子的时候，每孔加350ul左右。注意事项：1.每次洗涤的时候，尽量拍干孔中液体。这样洗涤得比较干净。2. 孔中没有液体时候，动作一定要快！！！ELISA包被后的孔，不能干掉！否则非常影响结果。3.封闭。用是1%BSA in 1XPBS. 无菌过滤，4度保存，用之前放在室温复温。封闭液可以封闭全孔，所以每孔加300UL封闭液，室温1小时。4. 弃掉封闭液，拍干。洗涤三遍。步骤如前。5. 加标准品和样品。标准品储存浓度很高，而且蛋白很忌反复冻融。建议次使用时，分装。可以48孔一只，-80度冰箱保存，可以有效保存半年。4度保存，有效期是60天，而且浓度会衰减。取16孔标准品的量。举例，我的标准品储存浓度是270ng/ml, 标准品分7个点，浓度是1000pg/ml，每孔100ul, 2倍递减，所以是1000， 500， 250， 125， 62.5 ， 31.2， 15.6 pg/ml, 7个孔我需要0.2ng标准品。做ELISA必须有复孔。所以，两排14个孔我需要0.4ng标准品, 1.5ul。标准品稀释步骤：取7个EP管，第1管放400ul缓冲液，第2到7管放200ul缓冲液。将1.5ul标准品加入到管中，200ul枪轻轻吹打混匀。从第1管中取200ul加入第2管中，吹打均匀。依次稀释。第7管有400ul液体，zui后只用200ul。标准品加样步骤：从第1管中取100ul加到A1孔，再100ul加到A2复孔中。第2到7孔，参考上述步骤。第8孔，H1和H2加没有标准品的缓冲液，作为阴性对照。样本加样：血清或者细胞上清，解冻之后混匀，建议3000RPM离心10分钟，沉淀液体中的固体杂质。按照顺序，每孔加100ul样本，记得做复孔。加样体积一定要一样，但是动作要快。样本还是一定要保证加到管底，不要粘附到管壁上。标准品和样品，每孔100ul，室温孵育2小时。6. 弃掉液体，拍干。洗涤3遍。7. 加检测抗体（detection antibody,尾端有*biotin），每孔100ul（储存液也是放-80度，用之前解冻后加缓冲液混匀，稀释到工作浓度，缓冲液的PH值都已经调到7.2-7.4之间）。室温孵育2小时。备注：以上这些步骤没有要求避光。所以，每次加样之后，只要保证把贴膜都贴牢，防止液体蒸发和孔间干扰即可。板子可以放在操作台上。不过因为操作习惯，即使不避光的步骤，也可以把板子放在室温的抽屉里。8.弃掉检测抗体液，拍干。洗涤三遍。9. 加Streptavidin-HRP(亲和素-辣根过氧化物酶)，这个一直4度保存，使用的时候200倍稀释（96孔，9.6ML液体，加48ul的Streptavidin-HRP，9552ul的缓冲液）。100ul每孔，室温，避光（这步开始要避光），孵育20分钟。10. 弃掉液体，拍干。洗涤三遍。11. 加底物液（substrate solution）,A液：B液=1:1，用之前临时混起来。储存的时候A，B两液分别储存在4度冰箱。每孔100ul（等于每孔A液50ul，B液50ul），室温，避光，20分钟。

*半*连接酶催化亚基elisa

Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶1Aelisa

组蛋白脱乙酰基酶1elisa

*1βelisa

Bcl2关联X蛋白elisa

血管生成素样蛋白2elisa

抗肌蛋白elisa

钠/钾离子转运ATP酶β4肽elisa

UDP葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶elisa

半*丰富血管生成诱导因子61elisa