FerroFarRed (Fe²⁺indicator) 亚铁离子荧光探针

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FerroFarRed；FeRhoNox-1；FerroOrange；Labile ferrous ion 不稳定铁(II)离子；Fe2+荧光探针Ferroptosis 铁死亡；C11 BODIPY 581/591 脂质过氧化探针；

产品信息

产品描述

FerroFarRed，也称为SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一种特异性检测不稳定的铁(II)离子（Fe2+）的荧光探针。FerroFarRed基本无荧光，一旦与Fe2+反应后，不可逆的生成一种远红荧光产物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，图1. FerroFarRed的光谱特征）。生理浓度下的铁（III）离子（Fe3+）或其它除铁离子以外的二价金属离子都不会使其荧光增强（见图2. FerroFarRed的金属离子反应特异性）。FerroFarRed具细胞膜渗透性和高选择性，且在高达100μM的浓度下对细胞几乎无毒性，适用于活细胞内Fe2+的检测，倾向定位在内质网（ER）。适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、荧光酶标仪以及流式细胞仪（配置红色激光器）分析。

图1.FerroFarRed的光谱特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光谱（左）和荧光光谱（右）。FerroFarRed的最大吸收波长在646nm，而最大荧光波长在662nm。

图2.FerroFarRed的金属离子反应特异性。FerroFarRed（5 μM）与各种金属离子反应后，用荧光酶标仪测定荧光强度（激发波长：630nm，发射波长665nm）。可见，仅与Fe2+反应后发生显著的荧光增强。

保存与运输方法

保存：≤-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

运输：冰袋运输。

注意事项

1）   FerroFarRed倾向定位在内质网，但也可能检测细胞质池内的Fe2+，目前针对这一点未做明确评估。

2）   荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

一、 需要自行准备的材料

1.1 细胞培养级或超纯DMSO（比如：MS4601A-100ML）【强烈建议将高纯的DMSO分装成单次用量保存在极低温冷冻室内，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能会增加FerroFarRed的背景信号】

1.2 合适的观察缓冲液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚红。

1.3    无血清细胞培养基（D-MEM等）

二、探针准备

2.1从冰箱取出FerroFarRed，置于室温回温至少30min，将其置于微量离心机内低速离心。将瓶内的粉末离心到管底后，再开盖。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）内加入50μl 高质量DMSO，用枪反复吹吸5次或以上，使其完quan溶解即得到1mM FerroFarRed储存液。【注意：FerroFarRed是蓝色固体，但溶液几乎无色（浅蓝色）】。建议单次用完储存液，若实在用不完，请根据单次用量分装，置于-80℃避光保存。用中性缓冲液来稀释储存液。

三、HeLa细胞Fe2+的染色步骤（荧光成像分析）

3.1 在玻底培养皿内接种细胞，培养过夜。

3.2从培养皿内吸走培养基，用合适的观察缓冲液（比如：HBSS）清洗两次。

3.3 用无血清细胞培养基稀释1uM FerroFarRed储存液，制备成5mM的染色工作液。

3.4 将染色工作液加入培养皿内，于37℃孵育1h。

【注意：①建议根据细胞类型和自身实际需求优化工作浓度和孵育时间。②如果细胞很容易从培养皿上脱落，建议使用多聚L-赖氨酸或其它包被基质包被的培养皿来接种细胞。】

3.5 染色后用观察缓冲液（比如：HBSS）清洗一次，替换成新的观察缓冲液。

3.6 在荧光显微镜下观察细胞。

四、HepG2细胞Fe2+的测定（流式分析）

4.1 于多孔培养板内接种细胞，过夜培养。

4.2 从培养板内吸走培养基，用合适的观察缓冲液（比如：HBSS）轻轻的清洗两次。

4.3 用无血清细胞培养基稀释1uM FerroFarRed储存液，制备成5mM的染色工作液。

4.4 将染色工作液加入培养板内，于37℃孵育1h。

【注意：建议根据细胞类型和自身实际需求优化工作浓度和孵育时间。】

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% yi酶-EDTA消化细胞。

4.6 于冰上用PBS稀释0.25% yi酶-EDTA，之后500 x g离心细胞悬液5min，以沉淀细胞。

【注意：不可用血清来中和yi酶。】

4.7 吸走上清，用PBS重悬细胞。

4.8 用细胞筛网（40μm尼龙筛网）过滤细胞，去除细胞碎片。

4.9 上机，流式细胞仪分析。

五、荧光检测

对于激光激发：635nm波长左右的激光器比较适合。荧光在660nm左右观察。

对于荧光显微镜观察：选择检测Cy5的红色激发滤片。对于流式分析，选择检测APC的滤片。

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FerroFarRed的染色示例（来自文献）

Ref 1. Li Z, Jiang L, Chew SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant

mesothelioma under hypoxia. Redox Biology. 2019 Sep;26:101297. DOI: 10.1016/j.redox.2019.101297. PMID:

31442913; PMCID: PMC6831888.

检测方法（Fe(II)的细胞定位）：Catalytic Fe(II) was detected with a fluorescent turn-on probe, SiRhoNox-1 (FerroFarRed;), as previously described. Cells (5 × 104) were cultured in normoxia on 35-mm glass bottom dish  for 16 h at 37 °C. After treatment with CA9 inhibitors under hypoxia for 48 h, cells were co-stained with 5 μM of SiRhoNox-1 and 200 nM of LysoTracker Green in FluoroBrite DMEM for 30 min at 37 °C in normoxia, followed by incubation with 75 nM of MitoTracker Red for another 30 min. We confirmed that 1-h incubation in FluoroBrite DMEM containing 0.1 mg/L (0.25 μM) Fe(NO3)3 scarcely affects iron metabolism of the cells within this limited period. Medium was replaced with new FluoroBrite DMEM, followed by observation with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss; Oberkochen, Germany). The excitation/emission used for SiRhoNox-1, LysoTracker and MitoTracker probes were 633/670, 504/511 and 579/599 nm, respectively. Local signal intensity of the regions overlapped with each organelle-trackers were analyzed with ZEN Imaging Software (Carl Zeiss).

Fig. 1  CA9 overexpression in MM cells correlates with increased catalytic Fe(II) in response to hypoxia. (F) Differential levels of catalytic Fe(II) in normoxia or hypoxia of ACC-Meso-1 cells were determined by staining with SiRhoNox-1 (5 μM), followed by evaluation with a flow cytometer after 48 h-incubation. (G) Localization of catalytic Fe(II) in normoxic or hypoxic ACC-Meso-1 cells were analyzed by co-staining of SiRhoNox-1 (5 μM), LysoTracker (200 μM) and MitoTracker (75 μM) after 48 h-incubation and observation with a confocal microscope. Integrated intensity per cell (N =7) was quantified by ZEN Imaging Software (ZEISS) (means ± SEM; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P< 0.001 vs each control unless indicated by bar). Refer to text for details. SM, sarcomatoid mesothelioma; EM, epithelioid mesothelioma; N, normoxia; H, hypoxia; A.U., arbitrary unit.

— —Written/Edited by V. Shallan【版权归MKBio懋康所有】

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