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基因蛋白组分离的方法

时间:2016-06-15      阅读:389

   ELISA试剂盒基因芯片是生物芯片的一种,其上固定的是核算类物质,主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。

   分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的(标)基因。目前是通过①比较不同物种之间,或同一物种不同个体之间;或同一个体在不同生长发育是期或不同环境条件下基因差异表达(基因表达平行分析)来实现的。采用基因芯片技术进行基因差异表达研究可以通过杂交直接检测到细胞中mRNA的种类及丰度,与传统的差异显示相比具有样品用量小,自动化程度高,被检测目标DNA密度大及并行种类多等优点。②利用同源探针从cDNA或EST微列阵中筛选分离目的基因。目前有DNA芯片、cdna芯片两种。其基本步骤包括:基因芯片的制备、靶样品制备、杂交与检测、目的基因得分离并获得全长。

    基因文库技术分离目的基因基因文库指某一生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体的形式出现。某生物DNA片段群体与载体分子重组,重组后转化宿主细胞,转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落(或噬菌斑,或成活细胞)即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。其类型很多,如可分为基因组文库与cdna文库、克隆文库与表达文库,按载体分有智力文库、噬菌体文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后,从文库中筛选基因的方法主要有以下几种:核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作,也是分离目的进的常用方法之一。

   功能蛋白组分离目的基因蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式,即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析,在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如:应用PCR进行分离目的基因:通过对蛋白质的序列分析,可以通过密码子的简并性设计简并引物,可利用RT-PCR得到目的基因的全长;应用核算杂交筛选法分离目的基因:即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库;免疫雪筛选法分离目的基因:是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合,从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。

    PCR技术在基因克隆中的应用PCR技术已经渗透到生物学的各个领域,在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示(DDRT-PCR)可鉴定和分离出所需的目的基因;通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建,通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的PCR方法主要有:RT-PCR,DDRT-PCR,用于cDNA末端快速克隆的RACE(第3小节),用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。

    mRNA差别显示技术分离差别表达基因mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo(dT)12MN和3’端随机引物对总mRNA进行PCR扩增,以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。

ELISA试剂盒

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