人杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）ELISA检测的操作步骤如下：

洗涤步骤

加入洗涤缓冲液（1× PBS或厂家指定缓冲液）至各孔，静置30秒后弃去液体，重复3次。次洗涤后，将微孔板倒扣于吸水纸上轻拍，确保孔内无残留液体。注意避免交叉污染，建议使用多道移液器或自动洗板机以提高效率。

酶标抗体孵育

按说明书稀释标记的检测抗体，每孔加入100 μL，覆盖板底。封板膜密封后，37℃孵育60分钟。若室温（25℃）操作，需延长孵育时间至90分钟以确保充分结合。

二次洗涤

重复步骤6的洗涤流程，进一步去除未结合的检测抗体。此步骤对降低背景信号至关重要，建议增加至5次洗涤（高灵敏度检测时）。

显色反应

每孔加入新鲜配制的TMB底物溶液100 μL，避光室温反应15-20分钟。若观察到标准品孔呈现明显梯度蓝色即可终止；若显色过弱，可延长至30分钟（需同步延长所有孔反应时间）。

终止与读数

加入50 μL 2M硫酸终止液，轻震混匀后立即用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度（OD值）。若仪器支持双波长校正，建议设定630 nm为参比波长以减少孔间误差。

注意事项

- 样本处理：血清/血浆需离心去除纤维蛋白，避免溶血；细胞培养上清需0.22 μm滤膜过滤。

- 标准曲线拟合：建议采用四参数逻辑（4PL）回归模型，确保低浓度区准确性。

- 质量控制：每板应包含空白孔（仅加缓冲液）、阴性对照（不含BPI的样本）及复孔，CV值需＜15%。

常见问题分析

- 高背景信号：检查洗涤是否充分，或抗体浓度是否过高。

- 标准曲线线性差：确认标准品稀释准确性，避免反复冻融。